黃瀟，趙智勇，蔡穎慧

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法＊

黃瀟1，趙智勇1，蔡穎慧2

（1.山西省分析科學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.山西省生物研究院有限公司，山西 太原 030006）

對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法進(jìn)行了綜述，主要有生物化學(xué)研究方法和分析生物學(xué)研究方法兩大類。生化法研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法主要包括微生物平板記數(shù)法、底物利用分析法、生物標(biāo)記法。土壤微生物在基因水平上的群落結(jié)構(gòu)研究可以用核酸雜交技術(shù)、DNA成分多態(tài)性圖譜分析、DNA長度多態(tài)性圖譜分析、土壤宏基因組學(xué)、高通量測序技術(shù)等進(jìn)行研究。目前，分子生物學(xué)、基因技術(shù)已在微生物群落結(jié)構(gòu)研究中獲得了很大關(guān)注，高通量測序技術(shù)和基因組學(xué)技術(shù)也得到了更廣泛的應(yīng)用。綜上所述，每個方法都有各自的有優(yōu)缺點，在實際選取時需要結(jié)合實際情況。

土壤；微生物群落結(jié)構(gòu)；研究方法；分子生物學(xué)

1 前言

土壤微生物維持著土壤物質(zhì)循環(huán)和生態(tài)平衡，在植物養(yǎng)分轉(zhuǎn)換中起著重要的作用，是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分。土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)對土壤生態(tài)系統(tǒng)有很大影響，在調(diào)節(jié)土壤生態(tài)系統(tǒng)、環(huán)境治理和資源可持續(xù)利用方面具有重要意義。研究土壤微生物多樣性的方法有生物化學(xué)成分分析法和現(xiàn)代分子水平分析法兩大類。對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究涉及多學(xué)科領(lǐng)域，如土壤學(xué)、微生物學(xué)及生態(tài)學(xué)等。該項研究對應(yīng)對全球氣候變化、各類環(huán)境污染治理及維持生態(tài)功能等方面有重要意義。

2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的生化研究方法

生物化學(xué)法以生化角度為依據(jù)，主要包括平板記數(shù)法、底物利用分析法、生物標(biāo)記法3種。

2.1 平板技術(shù)——培養(yǎng)鑒定法

此法用平板對細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)，后依據(jù)微生物菌落的數(shù)量和菌落的形態(tài)特征來判定微生物的數(shù)量及類型。該方法速度快，但無法重復(fù)土壤真實的生物指標(biāo)，培養(yǎng)獲得的微生物數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實際微生物數(shù)量，甚至不足1%，該方法有一定的限制性和片面性，已逐漸被其他方法所替代[1]。

2.2 底物利用分析法

底物利用分析，主要有Biolog法，利用不同土壤微生物所需的碳源形式不同，比較鑒定微生物群落結(jié)構(gòu)。譚兆贊等人用Biolog法分析了土壤微生物中的特征碳源，結(jié)果表明特征碳源對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化更敏感。Biolog碳素利用法再現(xiàn)土壤微生物群落的原代謝特征，且靈敏度高、簡單快速、自動化程度高，但僅限于檢測可培養(yǎng)、能迅速生長的微生物[2]。

2.3 生物標(biāo)記法

生物標(biāo)記法中常用的主要有磷脂脂肪酸（PLFA）分析法，磷脂脂肪酸在活細(xì)胞中的含量相對恒定，但在死亡的細(xì)胞中會迅速分解。PLFA分析技術(shù)由WHITE首次提出，常用于計算總生物量。2004年，TOMOYOSHI等人發(fā)現(xiàn)了大米土壤中細(xì)菌群落多樣性和PLFA量呈比例關(guān)系。PLFA分析技術(shù)已被應(yīng)用于對森林土壤、植物根際土壤、火災(zāi)跡地土壤、植物入侵地土壤等微生物多樣性的研究方面[3]。PLFA分析法具有以下優(yōu)點：能直接有效地提供微生物群落中的信息；對細(xì)胞生理活性沒有特殊的要求；不受質(zhì)粒損失或增加的影響，實驗結(jié)果更為可靠。該方法經(jīng)過不斷發(fā)展完善，目前多采用GC-MS方法，較為準(zhǔn)確、快捷。

3 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)研究方法

隨著微生物研究技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛運(yùn)用，為生物多樣性研究提供了新的分析方法，豐富了土壤微生物結(jié)構(gòu)研究方法。

3.1 核酸雜交技術(shù)

根據(jù)已知的核酸探針與待測樣品中的核酸序列形成特異性互補(bǔ)的原理，通過對雜交信號的熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記的檢測分析，得到土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征[4]。熒光原位雜交（FISH）技術(shù)已應(yīng)用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)檢測方面，它具有簡便快速、靈敏度高、探針保存期長等優(yōu)點。

3.2 DNA成分多態(tài)性圖譜分析

DNA成分多態(tài)性圖譜分析，主要有DGGE和TGGE，即變性劑濃度梯度凝膠電泳和溫度梯度凝膠電泳。DGGE應(yīng)用最為廣泛，主要原理是：長度相同而序列不同的DNA片段有不同的解鏈行為，凝膠分離后停留在不同的位置，能將同樣大小的DNA片段很理想地分開。TGGE則是利用溫度梯度變性的原理，對不同核苷酸片段進(jìn)行分離與分析。 DGGE一般包括三個步驟：核酸提取，16SrRNA序列PCR擴(kuò)增和指紋圖譜分析。DGGE和TGGE是很有用的分子標(biāo)記方法，具有方便、結(jié)果分辨率高等特點，在分子微生物生態(tài)學(xué)研究中得到廣泛使用。張平究等人用DGGE方法研究了長期不同施肥條件下水稻土中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化[5]。

3.3 DNA長度多態(tài)性圖譜分析

DNA長度多態(tài)性圖譜分析最常用的是RFLP和T-RFLP法，即限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)和末端限制性片段長度多態(tài)技術(shù)。RFLP法，是一種依據(jù)DNA多態(tài)性研究微生物多樣性的方法。方法程序為：用限制性內(nèi)切酶酶切提取的DNA，后用凝膠電泳分開DNA片段，再把DNA片段轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的DNA片段（Southern雜交）。王英等人用RFLP技術(shù)對免耕水稻土壤中細(xì)菌的多樣性和空間分布研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌種類非常豐富，而且在不同層的土壤中存在空間差異性。T-RFLP技術(shù)與RFLP的原理相同，區(qū)別在于標(biāo)記引物不同。T-RFLP是一種高效可重復(fù)的技術(shù)，它可以對一個生物群體的特定基因進(jìn)行定性和定量測定，彌補(bǔ)了RFLP技術(shù)的局限性，簡化了圖譜，并且更準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。DING等人采用T-RFLP技術(shù)研究了植物內(nèi)生細(xì)菌的多樣性和動態(tài)變化。BARRETO等人用T-RFLP技術(shù)研究熱帶湖泊沉積物中，細(xì)菌、古細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌的空間分布規(guī)律。該法優(yōu)點是不需要純培養(yǎng)菌株，方法效率高、特異性強(qiáng)；缺點和局限性主要是假末端限制性片段的形成，可能導(dǎo)致對微生物多樣性的過多估計，引物和限制酶的選擇也是很重要的。

3.4 土壤宏基因組學(xué)

宏基因組學(xué)（Metagenomics）主要含義是：以特定環(huán)境中全部微生物的總DNA作為研究對象，著眼于功能基因的挑選，研究微生物群落結(jié)構(gòu)演化關(guān)系及與環(huán)境之間的相互關(guān)系，不依賴于微生物的分離與培養(yǎng)，因而減少了由此帶來的瓶頸問題。該方法是1998年由HANDELSMAN等人首次提出的，對土壤微生物的豐度和種類進(jìn)行了系統(tǒng)化研究，并構(gòu)建16SrRNA基因文庫。優(yōu)點是能更好地研究那些不能被分離培養(yǎng)的微生物，并通過整個群落環(huán)境及個體間相互影響，發(fā)現(xiàn)微生物群落共存特性。2014年，SMEDILE等人利用宏基因組學(xué)研究了地中海深海高鹽缺氧盆地的微生物系。2016年，南京農(nóng)大基于Illumina的16SrRNA測序方法研究表明人參果的種植增加了喀斯特地區(qū)細(xì)菌群落的多樣性和豐度。

3.5 高通量測序技術(shù)

高通量測序技術(shù)，是近幾年發(fā)展起來的測序技術(shù)，主要分為三代。Sanger測序法，即雙脫氧核苷酸終止法是第1代高通量測序技術(shù)。方法流程為：樣本準(zhǔn)備、文庫構(gòu)建、測序反應(yīng)及數(shù)據(jù)分析。第2代測序技術(shù)，主要指3個高通量測序平臺，主要包括Illumina 公司的Solexa合成測序平臺、Roche公司的454焦磷酸測序平臺和ABI的SOLiD連接法測序平臺。此技術(shù)可以檢測到低豐度微生物群落，且分析準(zhǔn)確性得到很大提高。以單分子實時測序和納米孔為標(biāo)志的第三代測序技術(shù)，依據(jù)熒光標(biāo)記的脫氧核苷酸、納米微孔和共聚焦顯微鏡這3個關(guān)鍵技術(shù)，短時間可以讀取幾千個堿基，且準(zhǔn)確度高于99.99%，主要有太平洋生物科學(xué)（Pacific Biosciences）公司推出的單分子實時DNA測序技術(shù)（Single Molecule Real Time，SMRT）、牛津納米孔技術(shù)公司（Oxford Nanopore Technologies Ltd）的納米孔單分子測序技術(shù)和生物科學(xué)（BioScience）公司的HeliScope單分子測序儀[6]。高通量測序技術(shù)現(xiàn)已作為研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法被廣泛關(guān)注。

4 小結(jié)與展望

從生物化學(xué)成分分析到現(xiàn)代分子生物學(xué)，每一種分析方法都能從一個角度揭示土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的特征，優(yōu)缺點共存，同時也存在著一定的局限性。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展成熟和實驗成本下降，高通量測序、宏基因組學(xué)會被更加廣泛關(guān)注和應(yīng)用。綜上所述，每個方法都有各自的優(yōu)缺點，在實際應(yīng)用中需要結(jié)合實際情況做出選擇，在研究中盡可能獲得更為全面準(zhǔn)確的信息，甚至建立全方法信息庫，或許是今后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究的趨勢。

［1］劉國華，葉正芳，吳為中.土壤微生物群落多樣性解析法：從培養(yǎng)到非培［J］.生態(tài)學(xué)報，2014，32（14）：4421-4433.

［2］朱菲瑩，肖姬玲，張屹，等.土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究方法綜述［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（10）：112-115.

［3］劉搖微，王樹濤，陳英旭.轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物多樣性的磷脂脂肪酸（PLFAs）表征［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報，2011，22（3）：727-733.

［4］鐘文輝，王薇，林先貴，等.核酸分析方法在土壤微生物多樣性研究中的應(yīng)用［J］.土壤學(xué)報，2009，46（2）：334-341.

［5］蔡晨秋，唐麗，龍春林，等.土壤微生物多樣性及其研究方法綜述［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（28）：17274-17278.

［6］李潔，李睿玉，楊紅，等.土壤微生物多樣性的研究方法［J］.山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（11）：1738-1742，1746.

S154.3

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2020.12.014

2095－6835（2020）12－0036－02

山西省青年科技研究基金項目（編號：201601D202088）

黃瀟（1984—），女，碩士，副研究員，研究方向為微生物學(xué)。

蔡穎慧。

〔編輯：嚴(yán)麗琴〕