金永祚，曹昺焱，李 瑞△，張婧怡，宋姍姍，金奉奎

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029； 2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091)

糖尿病患病人數(shù)日趨增多，中國(guó)的2型糖尿病(T2DM)流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，成人T2DM患病率為10.9%，40歲以下患病率高達(dá)5.9%，發(fā)病已有年輕化傾向[1]。T2DM是以高血糖癥為主要特征并伴胰島素抵抗(IR)或胰島素相對(duì)分泌障礙的慢性代謝性疾病。其中IR貫穿于T2DM病程的所有階段，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用。IR的發(fā)生主要涉及骨骼肌、脂肪、肝臟組織。其中骨骼肌攝取約80%的葡萄糖，是維持恒定血糖平衡和利用葡萄糖的重要組織[2]，因此骨骼肌在IR中占有至關(guān)重要的地位。胰島素主要通過磷脂酰肌醇3激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)信號(hào)途徑進(jìn)行代謝調(diào)節(jié)，該途徑與IR相關(guān)的T2DM具有密切關(guān)系。因此從骨骼肌的PI3K信號(hào)途徑探究針刺改善胰島素抵抗的分子機(jī)制有重要意義。西醫(yī)對(duì)糖尿病的治療主要采用口服降血糖藥和注射胰島素，但使用劑量或用藥不當(dāng)會(huì)出現(xiàn)低血糖，長(zhǎng)期服用降血糖藥有損害肝腎功能的危險(xiǎn)，難以避免副作用[3]。糖尿病是當(dāng)前公共健康所面臨的重大問題，已被確定為代謝疾患重點(diǎn)疾病。針刺療法屬于非藥物療法的中醫(yī)學(xué)方法之一，其具有多方面優(yōu)勢(shì)而無副作用，并已大量實(shí)驗(yàn)表明電針對(duì)IR有一定的改善作用[4]。故本實(shí)驗(yàn)通過電針治療自發(fā)性2型糖尿病ZDF大鼠，觀察其對(duì)骨骼肌中PI3K之亞基p85和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為7只體質(zhì)量140～160 g(2月齡)的SPF級(jí)雄性ZL(fa/+)(Zucker Lean)大鼠以及14只同月齡SPF級(jí)雄性ZDF(fa/fa)(Zucker Diabetic Fatty)大鼠。全部動(dòng)物購(gòu)自北京維通利華公司。動(dòng)物于23 ℃、空氣流通、相對(duì)濕度60%、12 h晝夜循環(huán)光照的條件下飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)于4周誘導(dǎo)飼養(yǎng)后開始進(jìn)行，適應(yīng)性飼養(yǎng)期間，如無特殊需要，動(dòng)物自由飲食水。按北京維通利華公司建議，在誘導(dǎo)飼養(yǎng)及成模后干預(yù)期間，全部動(dòng)物均以Purina #5008飼料喂養(yǎng)。

1.2 動(dòng)物飼料

Purina #5008飼料(組成：粗蛋白≥23.0%，粗脂肪≥6.5%，粗纖維≤4.0%，粗灰分≤10%，水分≤11.0%，磷≥0.65%，鈣0.75%～1.25%；原料組成：玉米粉，脫殼大豆粉，小麥粉，魚粉，麥麩，啤酒酵母，蔗糖蜜，麥芽，甜菜粉，燕麥粉，大豆粉，脫水苜蓿草粉，大豆殼粉，礦物質(zhì)和維生素)。

1.3 實(shí)驗(yàn)耗材及試劑

羅氏ACCU-CHEK血糖儀(LOT 10129770，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);羅氏血糖試紙(LOT 24685431，羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司);大鼠[許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司];中研太和牌針灸針0.13 mm×7 mm (212161123，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司);兔Anti-PI3K p85抗體(Cell Signaling);鼠Anti-GLUT4抗體(Cell signaling)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組

ZDF大鼠誘導(dǎo)飼養(yǎng)4周后，以空腹血糖(FBG)均>11.1 mmol/L為成模標(biāo)準(zhǔn)。成模的ZDF大鼠依空腹血糖排序隨機(jī)區(qū)組分為兩組：模型組，電針組。7只ZL對(duì)照大鼠作為對(duì)照組。

2.2 治療

2.2.1 對(duì)照組及模型組 不干預(yù)。

2.2.2 電針組 將動(dòng)物固定于可伸出四肢的棉布鼠套靜置5 min，以0.13 mm×7 mm針灸針(中研太和牌無菌針灸針)針刺雙側(cè)“后三里”“三陰交”“脾俞”“胃脘下俞”。后三里位于大鼠后肢膝關(guān)節(jié)外下方當(dāng)膝骨小頭下5 mm；三陰交位于大鼠后肢內(nèi)踝尖直上10 mm；胰俞位于第8胸椎棘突下旁開7 mm；脾俞位于第11胸椎棘突下旁開7 mm[5]。直刺深度4～6 mm。連通電針儀(電針一端連接于“胃脘下俞”，一端連接同側(cè)“后三里”，形成回路)，連續(xù)波，頻率15 Hz，電流輸出強(qiáng)度2 mA，以大鼠肌肉輕微抖動(dòng)而不叫為宜，留針20 min，每周6次(周一至周六)，4周。以上各種干預(yù)操作均于每日13:00—18:00期間進(jìn)行，連續(xù)干預(yù)4周。干預(yù)第4周周六晚20:00禁食，周日早8:00檢測(cè)空腹血糖。

2.3 樣本采集及指標(biāo)檢測(cè)

所有動(dòng)物于全部干預(yù)結(jié)束后，自由飲食水，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束當(dāng)晚22:00禁食，次日早8:00以2%戊巴比妥鈉溶液按照45 mg/kg的藥量比腹腔注射麻醉，取部分大鼠股四頭肌，置于-80℃冰箱中保存，用于Western blot法檢測(cè)PI3K p85和GLUT4蛋白表達(dá)(所有組織均取自動(dòng)物同一部位)。

2.4 Western blot法檢測(cè)骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表達(dá)

依據(jù)末次干預(yù)后空腹血糖數(shù)據(jù)，每組隨機(jī)抽取3樣本，每樣本取100 mg骨骼肌，加入1 mL含蛋白磷酸酶抑制劑的裂解液于研磨器中勻漿后，冰上靜置30 min(期間每5 min渦旋振蕩1次)，4℃環(huán)境10 000 rpm離心15 min，提取上清液配平并煮沸(95℃，5 min)變性后，上樣，電泳(濃縮膠部分電泳條件80 V，30 min)；分離膠(濃度10%)部分電泳條件120 V，60 min。以80 V、70 min的條件將蛋白濕轉(zhuǎn)至0.45 μm孔徑的PVDF膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉，40 r/min室溫孵育1 h，加入一抗，40 r/min室溫孵育1 h后，于4℃環(huán)境下孵育16 h。此后經(jīng)洗膜，二抗孵育后，于暗室曝光。數(shù)據(jù)處理：以Image J軟件計(jì)算條帶IOD(Integrated option density，總灰度值)作為表達(dá)量。以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算骨骼肌中PI3K p85和GLUT4相對(duì)表達(dá)。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0進(jìn)行分析，采用單變量統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)方法比較不同組別樣本的差異。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用 ANOVA(多組檢驗(yàn))和Student’s t-test(兩組檢驗(yàn))進(jìn)行分析; 對(duì)于非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用Kruskal-Wallis H-test(多組檢驗(yàn))以及Mann-Whitney U test(兩組檢驗(yàn))進(jìn)行分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組大鼠空腹血糖水平

予4周誘導(dǎo)高質(zhì)高糖Purina #5008飼料喂養(yǎng)4周后與對(duì)照組對(duì)比，造模后模型組大鼠和電針組大鼠的FBG顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，模型組大鼠的FBG與電針組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明造模成功。

干預(yù)4周后與對(duì)照組比較，模型組和電針組血糖仍然顯著升高(P<0.05)，但電針組與模型組對(duì)比，明顯降低了FBG的數(shù)值，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

干預(yù)4周后與造模后組內(nèi)對(duì)比，對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;模型組的FBG較造模后FBG顯著升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但電針組干預(yù)4周后的FBG與造模后對(duì)比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 干預(yù)前與治療后各組大鼠FBG比較

3.2 各組大鼠骨骼肌中PI3K p85和GLUT4蛋白表達(dá)量比較

與對(duì)照組大鼠相比，模型組大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組大鼠比較，電針組大鼠骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明電針可調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)通路上關(guān)鍵分子PI3K p85、GLUT4。 見圖1、表2。

注：A組.對(duì)照組；B組.模型組；C組.電針組。圖1 各組PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)情況(Western blot法)

表2 各組PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)量比較

4 討論

T2DM屬于中醫(yī)學(xué)“消渴”“消癉”范疇，主要病機(jī)為脾腎虧虛、陰虛燥熱，據(jù)此確立健脾補(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰為治療原則。故采用李瑞老師豐富臨床經(jīng)驗(yàn)而總結(jié)的穴組結(jié)合電針治療方法，穴組以足三里、三陰交、脾俞和胃脘下俞為主穴，《針灸甲乙經(jīng)·五氣溢發(fā)消渴黃疸第六》曰:“熱中，消谷善饑……足三里主之。”足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)之合穴，足陽(yáng)明之脈氣由此處合入，可補(bǔ)脾胃之氣，使氣津兩生，津液得以敷布而治療消渴。三陰交為肝脾腎之交會(huì)穴，疏調(diào)足三陰之經(jīng)氣，滋陰健脾、益氣補(bǔ)血、調(diào)補(bǔ)肝腎。脾俞和胃脘下俞皆屬于背俞穴，調(diào)整與其相應(yīng)的臟腑功能，可疏通臟腑之氣，恢復(fù)其正常功能。胃脘下俞又稱為胰俞?！肚Ы鸱健吩?“消渴，咽喉干，灸胃脘下輸三穴各百壯?！倍^察電針不同穴位對(duì)2型糖尿病大鼠空腹血糖的影響，結(jié)果表明胃脘下俞較其他穴位降糖效果更優(yōu)[6]。因此該穴組共用，可標(biāo)本兼治，有健脾益腎、益氣養(yǎng)陰之功效。

骨骼肌為維持機(jī)體糖代謝的核心組織，其主要機(jī)制為通過對(duì)葡萄糖的吸收及糖原分解來維持恒定的血糖水平，在生理情況下，胰島素與骨骼肌細(xì)胞膜上的胰島素受體(InR)的α亞基結(jié)合，使InR的β亞基發(fā)生自身磷酸化，而胰島素受體底物-1(IRS-1)發(fā)生酪氨酸磷酸化。其與PI3K的p85調(diào)節(jié)亞單位相結(jié)合后催化p110，激活PI3K，并生成3磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)。而其與PI3K依賴性激酶-1(PDK-1)和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(AKT)的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，從而激活PDK-1，使AKT磷酸化被激活。AKT調(diào)節(jié)骨骼肌內(nèi)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT4)轉(zhuǎn)位，可使胰島素的生物活性得到激活，從而正常進(jìn)行葡萄糖的攝取，最終完成葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)[7]。GLUT4在骨骼肌組織中廣泛表達(dá)，在細(xì)胞表面數(shù)量增多，得到葡萄糖的攝取能力增強(qiáng)。故其在調(diào)節(jié)胰島素刺激的骨骼肌組織的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)中起著核心作用，是預(yù)防高血糖的關(guān)鍵性分子[8]。PI3K在緩解IR中調(diào)節(jié)機(jī)體對(duì)胰島素敏感性和糖脂代謝中起著重要作用[9]，有研究提示，在敲除機(jī)體的PI3K p85基因后會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的糖脂代謝紊亂[10]。另外研究提示氧化應(yīng)激引起PI3K表達(dá)量減少，從而阻礙胰島素信號(hào)傳遞[11]。故胰島素信號(hào)通路中出現(xiàn)障礙，骨骼肌對(duì)胰島素信號(hào)敏感性降低，而無法正常攝取及利用葡萄糖，最終引起血糖升高。因此該途徑在2型糖尿病發(fā)病中十分重要。

本研究采用了自發(fā)型T2DM模型ZDF大鼠，該模型值得較為完整的復(fù)制人類T2DM的發(fā)病過程，針對(duì)IR主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)PI3K途徑進(jìn)行研究。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)ZDF模型大鼠電針干預(yù)4周，檢測(cè)FBG的水平，電針組干預(yù)前與干預(yù)后比較FBG的水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但干預(yù)后電針組較模型組均有明顯降低(P<0.05)，提示該穴組具有改善糖代謝作用。Western blot檢測(cè)各組間骨骼肌PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)水平，模型組大鼠骨骼肌的PI3K p85、GLUT4蛋白表達(dá)均較對(duì)照組有明顯降低(P<0.01)，表明模型組大鼠骨骼肌內(nèi)存在胰島素信號(hào)傳導(dǎo)障礙，但電針組干預(yù)可使其顯著上調(diào)(P<0.01)。PI3K、GLUT4為胰島素受體結(jié)合后的主要下游因子，通過PI3K通路導(dǎo)致一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，故胰島素抵抗發(fā)生時(shí)PI3K通路活性會(huì)降低。由此結(jié)果提示電針能改善ZDF大鼠葡萄糖代謝及胰島素抵抗，是通過提高PI3K信號(hào)途徑中PI3K p85蛋白活化而激活PI3K，增加GLUT4蛋白表達(dá)和轉(zhuǎn)位，促進(jìn)大鼠骨骼肌的葡萄糖吸收及利用。

綜上所述，李瑞老師經(jīng)驗(yàn)穴組結(jié)合電針干預(yù)可有效控制ZDF大鼠血糖，改善骨骼肌細(xì)胞的胰島素抵抗，其機(jī)制可能是通過PI3K、GLUT4通路來實(shí)現(xiàn)。本研究有望作為電針干預(yù)與其通路作用的理論依據(jù)，但糖尿病是全身系統(tǒng)疾病，需要更多樣本對(duì)更多靶器官及與上游因子的關(guān)系進(jìn)一步闡明。