何金蓮

[摘 要] 丹參是我國重要的中藥材，含有多種生物活性物質(zhì)，可以治療多種疾病。丹參人工種植難度大，而且易導致品種退化，利用組織培養(yǎng)技術(shù)的繁殖速度快、易脫除病菌和病毒等優(yōu)點可以解決上述問題?；诖耍疚目偨Y(jié)丹參組織培養(yǎng)中選取外植體的方法、組織培養(yǎng)對培養(yǎng)基的要求、生長調(diào)節(jié)劑對出愈率和出芽率的影響、降低玻璃化率和褐化率的方法等，以供參考。

[關(guān)鍵詞] 丹參;外植體;生長調(diào)節(jié)劑;玻璃化;褐化

[中圖分類號] S567.53 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-7909（2020）28-91-2

丹參（Salvia miltiorrhiza Bge），為雙子葉唇形科鼠尾草屬植物，丹參干燥的根和莖常作為中藥。丹參的主要含有丹參酮、丹酚酸等生物活性物質(zhì)。丹參酮具有很高的醫(yī)用價值，有抗菌、消炎、促進傷口愈合等作用，對冠心病、心絞痛等疾病有一定的療效;丹酚酸B的抗氧化作用很強，是目前已知的抗氧化作用最強的天然產(chǎn)物之一，具有清除氧自由基、抑制脂類物質(zhì)過氧化反應的作用[1]。丹參在治療疾病方面發(fā)揮著巨大的作用，因而市場需求量很大。

近幾年，野生丹參被過量開采但需求量日益增加，野生資源已無法滿足人們的需求。丹參人工種植產(chǎn)量低，技術(shù)落后，只種不選的人工種植方式導致丹參品種退化嚴重。組織培養(yǎng)技術(shù)憑借繁殖周期短、易脫除病菌和病毒等優(yōu)點得到了廣泛應用，在提高天然藥物品質(zhì)和產(chǎn)量方面發(fā)揮了重要作用。推廣應用組織培養(yǎng)技術(shù)是目前解決丹參種植困難等問題的有效途徑。

1 外植體選擇

在丹參組織培養(yǎng)中，一般選取幼嫩外植體，如根系、莖段、葉片，因為其增殖能力較強，可有效減少褐化和污染等問題[2]。房師梅等研究表明，根系和莖段更易形成愈傷組織，但是從莖段誘導出的愈傷組織質(zhì)地較硬、數(shù)量較少、生長緩慢，易老化[3]。而且莖段為外植體時，分化速度較慢，一個月內(nèi)僅萌發(fā)10%左右的腋芽和叢生芽，隨著時間延長，叢生芽逐漸增多[4]。葉片作為外植體分化速度較快，7 d左右葉皺縮變厚，10 d左右分化出大量叢生芽。根的傷口誘導的愈傷組織質(zhì)地松散、數(shù)量多、生長旺盛，松散型愈傷組織在初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)中生長較快。因此，用根作為外植體生長效果更好，其次是葉片。有研究表明，用根作為外植體可有效降低褐化率。

2 培養(yǎng)基選擇

培養(yǎng)基是人工配制的、能滿足植物生長發(fā)育需求的營養(yǎng)基質(zhì)，篩選合適的培養(yǎng)基對培育優(yōu)質(zhì)丹參組培苗至關(guān)重要。丹參為典型的道地藥材，不同產(chǎn)地的丹參對培養(yǎng)基的需求不同，蔡朝暉等研究發(fā)現(xiàn)同一丹參的不同部位對培養(yǎng)基的需求也不同[5]。應用最多的基本培養(yǎng)基是MS或1/2MS培養(yǎng)基，其營養(yǎng)豐富且全面，能滿足組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)需求，能加速愈傷組織生長。

培養(yǎng)基的pH值一般在5.5～6.0，多控制在5.7～5.8。pH值會影響培養(yǎng)基的凝固，培養(yǎng)基偏酸性時，培養(yǎng)基凝固效果較差。調(diào)節(jié)pH值的次數(shù)應最好控制在一次，過多會引入一些其他離子，增加其他離子的濃度，并影響離子的溶解度。

生長調(diào)節(jié)劑對組織培養(yǎng)愈傷組織的誘導、芽的發(fā)生等各個階段起著重要的作用。例如，生長素2，4-D（二氯苯氧乙酸）可以強烈誘導丹參的愈傷組織，但對芽的形成有強烈的抑制作用，而且過量的2，4-D會產(chǎn)生毒害效應。2，4-D和細胞分裂素6-BA（6-芐基氨基嘌呤）搭配可使丹參莖、葉愈傷組織的誘導率最高[6]。周建國等研究表明，使用MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D 0.5 mg/L培養(yǎng)基，愈傷組織誘導率可達95%[7]。客紹英等研究表明，使用MS+6-BA1.0 mg/L+2，4-D 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基，愈傷組織誘導率最高達98.3%[8]。生長素NAA（萘乙酸）對誘導愈傷組織也具有較強的作用，但不及2，4-D效果明顯[9]，而6-BA和NAA的搭配使用可使芽增殖率升高，誘導出的根短且粗壯。已有研究表明，使用1/2MS+AgNO3 0.2 mg/L+6-BA 0.1 mg/L培養(yǎng)基，芽發(fā)生率達到85%[10]。孟倩等研究表明，使用MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基，生芽率可達98%[11]。赤霉素（GA、GA3等）可以促進幼芽伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株。生長素吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）對根的分化都有很強的誘導作用，促進生根能力為NAA>IBA>IAA。僅添加激素IBA，就能取得很好的生根效果，1/2MS+IBA 0.5 mg/L，生根率最高達到100%[4]，IAA和NAA的搭配也有很好的生根效果，MS+IAA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L生根率最高為92%[6]。AgNO3在促進愈傷組織器官發(fā)生及體細胞胚胎發(fā)育方面也有很強的作用，并且可以在一定程度上克服玻璃化。

3 褐化抑制

褐化是指在多酚氧化酶催化下酚類化合物氧化成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)會抑制其他酶類活性，對外植體或愈傷組織產(chǎn)生毒害，使細胞的正常代謝紊亂，甚至導致細胞死亡。影響褐化的因素較多，如基因型、外植體生長狀況等。褐化類型不同，危害程度也不同。外植體規(guī)格、部位選擇不當，均會導致褐化程度加深。褐化主要發(fā)生在初代培養(yǎng)及試管苗繼代培養(yǎng)過程中。

常見的防褐化劑（抗氧化物質(zhì)）有抗壞血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、活性炭（AC）。焦金鳳等研究表明，采用酒精進行外植體表面消毒，會加劇外植體褐化程度，而酒精滅菌時間短則褐化率降低，為8.89%[12]。外植體的幼嫩程度對褐化率有極顯著影響，如木質(zhì)化程度增加，褐化率加大[13]。低濃度的防褐化劑VC、PVP、Na2S2O3對抑制褐化有很好的效果。細胞分裂素及其濃度對褐化率有顯著的影響。例如，6-BA濃度為1.0 mg/L時，可有效降低褐化率[14]。在培養(yǎng)中添加適量的活性炭可以有效降低褐化率。利用其吸附能力吸附培養(yǎng)物分泌的抑制物及瓊脂中的雜質(zhì)，減少一些有害物質(zhì)的影響，可顯著降低試管苗的褐化率并促進生根。但1 mg活性炭能吸附培養(yǎng)基中100 mg左右的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，會削弱瓊脂的凝固能力，因此添加活性炭的量不能太多。

4 玻璃化抑制

在組織培養(yǎng)過程中，嫩莖、葉片呈半透明水漬狀的現(xiàn)象稱為玻璃化。產(chǎn)生玻璃化的因素很多，如取材部位及外植體大小、培養(yǎng)基類型、植物激素等條件不適合，均可能引起玻璃化現(xiàn)象。出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象會使組培苗的增殖系數(shù)大幅度降低，誘導生根困難。細胞分裂素和生長素比例嚴重失調(diào)或細胞分裂素濃度過高，易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象。KT（激動素）/NAA比例保持在3時，玻璃化現(xiàn)象緩解最明顯。在培養(yǎng)基中加入活性炭，也可以顯著降低玻璃化率[15]。培養(yǎng)基瓊脂的濃度不合適也會產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，適當提高瓊脂的濃度，以增加培養(yǎng)基的硬度，可以緩解玻璃化現(xiàn)象[16]。

5 結(jié)語

丹參市場需求量越來越大，而丹參種植十分困難，迫切需要發(fā)展丹參組織培養(yǎng)技術(shù)。選擇合適的外植體，合理配制培養(yǎng)基，抑制玻璃化、褐化，對丹參組織培養(yǎng)均有很大的影響。一般選取幼嫩外植體，其增殖能力較強，可減少褐化和污染等問題。低濃度防褐化劑對抑制褐化有很大的作用，活性炭能有效抑制玻璃化，但目前對抑制丹參玻璃化和褐化現(xiàn)象的研究還較少。丹參組織培養(yǎng)周期長、環(huán)節(jié)復雜，葉片和莖段作為外植體時褐化率和玻璃化率較高，目前的研究還無法用于工業(yè)生產(chǎn)，需進一步加強研究。

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