蔣英英，秦 星，張建軍，陳萬濤

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院·口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面-頭頸腫瘤科，國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市口腔醫(yī)學(xué)研究所，上海 200011；2. 濰坊醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔預(yù)防醫(yī)學(xué)教研室，濰坊 261053

頭頸癌是全球高發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響患者生命健康和生活質(zhì)量[1-2]?？谇话┳鳛槌Ｒ姷念^頸癌，約90%為口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC，簡(jiǎn)稱口腔鱗癌），其局部復(fù)發(fā)率高、轉(zhuǎn)移率高、預(yù)后較差。盡管手術(shù)、放射治療（放療）和化學(xué)治療（化療）等治療技術(shù)的發(fā)展提高了口腔鱗癌的局部控制，但其5 年生存率仍僅有60%左右；對(duì)于晚期口腔鱗癌患者，5 年生存率則更低[3]。口腔鱗癌的早期診斷和早期治療是控制病情、提高生存率的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[4]。因此，尋找新的口腔鱗癌診斷、預(yù)后和治療標(biāo)志物具有重要的臨床價(jià)值。

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是長(zhǎng)度大于200 個(gè)核苷酸但缺乏蛋白質(zhì)編碼潛能的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，參與DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯、細(xì)胞發(fā)育和分化等，是細(xì)胞生物學(xué)的重要調(diào)節(jié)因子[5-6]。近年來的研究[7]發(fā)現(xiàn)，lncRNA 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用；而在口腔鱗癌中，lncRNA 的異常表達(dá)與其發(fā)生進(jìn)展也存在密切關(guān)系，可能可以作為口腔鱗癌診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的生物標(biāo)志物或治療的靶點(diǎn)[8-9]。

本研究利用基因芯片與生物信息學(xué)技術(shù)，對(duì)6 例口腔鱗癌患者癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的差異表達(dá)lncRNA 進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)Ⅺ型膠原α1（collagen type Ⅺ alpha 1 chain，COL11A1） 的 非 編 碼 轉(zhuǎn) 錄 本 之 一COL11A1-208（ENST00000470170.1）在口腔鱗癌組織中高表達(dá)，提示其可能是調(diào)控口腔鱗癌惡性表型的關(guān)鍵分子之一。隨后通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）檢測(cè)COL11A1-208 在74 例口腔鱗癌患者癌組織內(nèi)的表達(dá)并比較不同臨床特征患者間的差異，評(píng)價(jià)其在口腔鱗癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)和診斷中的潛在價(jià)值，探討其在口腔鱗癌發(fā)生進(jìn)展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

所有組織樣本及臨床信息均來自“上海市口腔頜面部腫瘤組織樣本及生物信息數(shù)據(jù)庫共享服務(wù)平臺(tái)”（http://mdl.shsmu.edu.cn/OMNDB/page/data/data.jsp）。該信息庫的組織樣本收集儲(chǔ)存及定期隨訪均由專門技術(shù)人員負(fù)責(zé)。本研究已通過上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均已簽署知情同意書。

自信息庫選取2017 年3 月—2018 年3 月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔頜面-頭頸腫瘤科明確診斷為口腔鱗癌的患者，且入選對(duì)象均無術(shù)前放療、化療及其他治療史，排除全身其他惡性腫瘤史。術(shù)中口腔鱗癌及其癌旁組織（距離癌組織邊緣2 cm 以上的位置）離體后，迅速切成所需組織小塊，放入凍存管內(nèi)，并保存于液氮中；同時(shí)收集患者年齡、性別、煙酒習(xí)慣、病理分級(jí)、臨床分期（TNM 分期），有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部侵襲等臨床資料。術(shù)后通過查看原始病歷、電話訪問、門診復(fù)查的方式進(jìn)行定期隨訪，患者死亡則終止隨訪，最短隨訪時(shí)間為3 年（截止隨訪時(shí)間為2020 年8 月），期間電話隨訪連續(xù)3 次失敗則歸為失訪，并記錄無進(jìn)展生存期與總體生存時(shí)間。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol 試劑、PrimerScript-RT 試劑盒和qPCR 試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司，RNAlater 儲(chǔ)存液、mirVana ? miRNA 分離試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司。全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)（JXFSTPRP-64）購自上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（ABI StepOne）購自美國(guó)Life Technologies 公司，超微量分光光度計(jì)（NanoDrop ND-2000）購自美國(guó)NanoDrop 公司。本研究所用引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 lncRNA 基因芯片檢測(cè)

癌組織及癌旁組織離體后迅速放入RNAlater 儲(chǔ)存液中，預(yù)冷的無RNase PBS 緩沖液沖洗2 次，置于組織研磨機(jī)中勻漿1 min，使用mirVana ? miRNA 分離試劑盒提取組織總RNA 并進(jìn)行純化。lncRNA 基因芯片的檢測(cè)及初步分析由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成，其流程簡(jiǎn)述如下?？俁NA 使用超微量分光光度計(jì)進(jìn)行定量，運(yùn)用Agilent Bioanalyzer 2100 （Agilent Technologies）檢測(cè)RNA 完整性，使用Agilent Human lncRNA 芯片進(jìn)行檢測(cè)。將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并用Cyanine-3-CTP（Cy3）進(jìn)行標(biāo)記；然后將標(biāo)記好的產(chǎn)物和芯片雜交，洗脫后利用Agilent Scanner G2505C（Agilent Technologies）掃描得到原始圖像。最后，運(yùn)用Feature Extraction 軟件（version 10.7.1.1，Agilent Technologies）處理原始圖像提取原始數(shù)據(jù)，再用GeneSpring 軟件（version 12.5，Agilent Technologies）進(jìn)行quantile 標(biāo)準(zhǔn)化和后續(xù)處理。

1.4 組織RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄與qPCR 檢測(cè)

提取口腔鱗癌組織及癌旁正常組織RNA 前，標(biāo)本用預(yù)冷的無RNase PBS 緩沖液沖洗2 次，置于組織研磨機(jī)中勻漿1 min。用TRIzol 試劑提取組織的總RNA；用PrimerScript-RT 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照qPCR 試劑盒說明書配置反應(yīng)體系，反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本取3 個(gè)重復(fù)孔CT值平均數(shù)。

COL11A1-208 的上、下游引物序列分別為5'-GCTTCTGGCATCACAGTTCACT-3'和5' -GACACCTAATGACTCTTTTCCTCTT-3'，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）的上、下游引物序列分別為5' -GAACGGGAAGCTCACTGG-3'和5' -GCCTGCTTCACCACCTTCT-3'。

1.5 qPCR 的觀察指標(biāo)

qPCR 反應(yīng)以GAPDH 作為內(nèi)參，獲得各樣本組織ΔCT值（ΔCT=COL11A1-208 基因CT值－ GAPDH 基因CT值）；計(jì)算癌組織或癌旁組織的ΔΔCT值（ΔΔCT=癌或癌旁組織COL11A1-208 基因ΔCT值－同類組織中COL11A1-208 表達(dá)水平最低的ΔCT值）。分析癌組織及癌旁組織的COL11A1-208 基因表達(dá)水平時(shí)采用2－ΔΔCT值，分析不同臨床特征患者的癌組織COL11A1-208 基因表達(dá)水平時(shí)采用ΔCT值（表達(dá)水平越高，ΔCT值越?。?/p>

qPCR 中口腔鱗癌組織相對(duì)癌旁組織COL11A1-208 基因表達(dá)的fold-change（FC）值=癌組織2－ΔΔCT值/對(duì)應(yīng)癌旁組織2－ΔΔCT值，并以2 為底取對(duì)數(shù)值（log2FC），分析COL11A1-208 基因在口腔鱗癌中的表達(dá)水平。FC 值＞2，即認(rèn)為表達(dá)上調(diào)[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0 和GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和作圖。定量資料用x±s 表示，癌組織及癌旁組織間COL11A1-208 的表達(dá)差異采用配對(duì)t 檢驗(yàn)進(jìn)行比較；不同臨床特征的口腔鱗癌患者間COL11A1-208 的表達(dá)水平的比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（2 組比較用Mann-Whitney U 檢驗(yàn)，3 組及以上比較用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)）。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)組織COL11A1-208 水平在口腔鱗癌診斷中的潛能；Kaplan-Meier 法分析不同COL11A1-208 水平患者的生存時(shí)間。P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COL11A1-208 在lncRNA 基因芯片中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)6 例口腔鱗癌患者癌組織及其癌旁組織的lncRNA表達(dá)譜芯片進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，結(jié)果顯示，癌組織中呈低表達(dá)（FC 值＜0.5）的lncRNA 有45 個(gè)，呈高表達(dá)（FC 值＞2）的lncRNA 有30 個(gè)（圖1A）。在高表達(dá)的lncRNA 中，ENST00000470170（COL11A1-208）的FC 值最大（FC 值=12.32，P=0.000）；其長(zhǎng)度為785 bp，屬于非編碼蛋白的基因轉(zhuǎn)錄本（圖1B）。

圖1 6 對(duì)口腔鱗癌組織及其癌旁正常組織中差異表達(dá)的lncRNAFig 1 LncRNAs differentially expressed in six pairs of OSCC tissues and adjacent normal tissues

2.2 COL11A1-208 在qPCR 中的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果

對(duì)74 例口腔鱗癌患者癌組織及其癌旁組織cDNA 進(jìn)行qPCR 分析，發(fā)現(xiàn)COL11A1-208 在癌組織中顯著高表達(dá)（P=0.000，圖2A），相比對(duì)應(yīng)的癌旁組織，癌組織中COL11A1-208 表達(dá)上調(diào)（FC 值＞2）的樣本為52 例（圖2B）。

圖2 qPCR 檢測(cè)COL11A1-208 在口腔鱗癌組織及癌旁正常組織內(nèi)的表達(dá)Fig 2 Expression of COL11A1-208 in OSCC tissues and adjacent normal tissues determined by qPCR

2.3 COL11A1-208 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

對(duì)74 例口腔鱗癌患者的臨床資料進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：TNM 分期較晚（Ⅲ ～ Ⅳ期）的患者癌組織中COL11A1-208 的表達(dá)水平顯著高于TNM 分期較早（Ⅰ ～ Ⅱ期）者（P=0.001）；而口腔鱗癌組織中COL11A1-208 的表達(dá)水平在其他不同臨床特征患者間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

表1 不同臨床特征患者COL11A1-208 表達(dá)水平的比較Tab 1 Comparison of COL11A1-208 levels between the patients with different clinical features

Continued Tab

2.4 COL11A1-208 對(duì)口腔鱗癌診斷價(jià)值的分析

以最終病理診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)COL11A1-208在74 對(duì)口腔鱗癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁正常組織中的表達(dá)水平，應(yīng)用ROC 曲線分析其在口腔鱗癌診斷中的參考價(jià)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ROC 曲線的曲線下面積（area under the curve，AUC） 為0.702（95%CI 0.617 ～0.788）， 靈 敏度為87.8%，特異度為54.1%（P=0.000）（圖3），提示COL11A1-208 對(duì)口腔鱗癌的診斷具有一定的參考價(jià) 值。

圖3 COL11A1-208 的表達(dá)水平診斷口腔鱗癌的ROC 曲線圖Fig 3 ROC curve of COL11A1-208 expression in the diagnosis of OSCC

2.5 口腔鱗癌組織中COL11A1-208 的表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

根據(jù)癌組織COL11A1-208 相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)將74例口腔鱗癌患者分為COL11A1-208 高表達(dá)組（n=37）及低表達(dá)組（n=37）。Kaplan-Meier 生存分析和log-rank 檢驗(yàn)分析顯示，COL11A1-208 高表達(dá)組患者3 年總體生存率為51.35%（19/37），而低表達(dá)組患者3 年總體生存率為86.49%（32/37）；COL11A1-208 高表達(dá)組患者的3 年生存時(shí)間顯著短于低表達(dá)組患者（χ2=9.645，P=0.002）（圖4）。

圖4 COL11A1-208 不同表達(dá)水平的口腔鱗癌患者3 年總體生存率Fig 4 3-Year overall survival rate of OSCC patients with different COL11A1-208 expression

3 討論

口腔鱗癌是一種受多因素影響的疾病，其發(fā)生發(fā)展與表觀遺傳修飾、非編碼RNA 等多種因素有關(guān)。與絕大多數(shù)實(shí)體腫瘤一樣，早期診斷和治療是提高口腔鱗癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，因此探索更多與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子靶點(diǎn)至關(guān)重要[6]。lncRNA 作為近年來備受關(guān)注的一類非編碼RNA，在腫瘤形成、增殖和轉(zhuǎn)移的過程中起著廣泛的作用[11]；研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 的表達(dá)異常與多種類型腫瘤（如胃癌[12-13]、結(jié)腸癌[14]等）的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，有希望作為腫瘤早期診斷和治療的分子標(biāo)志物或基因治療靶點(diǎn)。已有報(bào)道指出，口腔鱗癌組織中異常表達(dá)的lncRNA，如miR-31 宿主基因（MIR31 host gene, MIR31HG）[15]、肌動(dòng)蛋白纖維相關(guān)蛋白1-反義RNA1（actin filament-associated protein 1-antisense RNA1, AFAP1-AS1）[16]、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1（metastasis-associated in lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1）[17]、尿路上皮 癌 胚 抗 原1（urothelial carcinoma antigen 1, UCA1）[18]和INK4 基因座中反義非編碼RNA（antisense non-coding RNA in the INK4 locus, ANRIL）[19]等，能夠促進(jìn)口腔鱗癌的轉(zhuǎn)移；另外，在口腔鱗癌組織中表達(dá)異常的lncRNA，如AFAP1-AS1[20]、母源性印記基因3（maternally expressed gene 3, MEG3）[21]、HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）[22]、1 號(hào) 染 色 體 上 的FAL1（focally amplified lncRNA on chromosome 1, FAL1）[23]等，均與口腔鱗癌患者的臨床特征有關(guān)；在口腔鱗癌中表達(dá)異常且調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)功能的lncRNA 有望成為口腔鱗癌預(yù)后、診斷的輔助指標(biāo)[24]。本課題組以往的研究[25]發(fā)現(xiàn)，lncRNA LINC00460 在口腔鱗癌組織的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和病理分級(jí)有關(guān)，提示LINC00460 可能作為口腔鱗癌精準(zhǔn)預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療的潛在靶點(diǎn)；lncRNA KTN1-AS1 在口腔鱗癌組織內(nèi)的表達(dá)水平與腫瘤大小、局部侵襲和復(fù)發(fā)有關(guān)，且檢測(cè)KTN1-AS1 聯(lián)合miR-153-3p 可提高口腔鱗癌診斷的敏感度和特異度，提示KTN1-AS1 有望成為口腔鱗癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的分子標(biāo)志物[26]。由此可見，lncRNA 作為口腔鱗癌預(yù)后預(yù)測(cè)和靶向治療靶點(diǎn)的前景十分廣闊。

本研究對(duì)口腔鱗癌組織lncRNA 表達(dá)譜芯片的結(jié)果進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)COL11A1-208 的表達(dá)明顯高于對(duì)應(yīng)癌旁正常組織。COL11A1-208 位于染色體1p21 區(qū)域，是由2 個(gè)外顯子組成的非編碼RNA 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是COL11A1 基因的轉(zhuǎn)錄本之一。近年來研究[27-28]發(fā)現(xiàn)，COL11A1 的異常表達(dá)與腫瘤（如頭頸鱗癌、卵巢癌、乳腺癌、甲狀腺癌、結(jié)腸癌、胃癌和非小細(xì)胞肺癌等）發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可作為腫瘤預(yù)后預(yù)測(cè)和診斷治療的潛在靶點(diǎn)。參考以往基因芯片結(jié)果[29-30]發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，COL11A1 在頭頸鱗癌組織中表達(dá)明顯升高；同時(shí)，COL11A1 在轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌組織中表達(dá)水平明顯高于未轉(zhuǎn)移的頭頸鱗癌組織[31]。該結(jié)果提示，COL11A1-208 可能對(duì)口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后產(chǎn)生一定的影響。本研究采用qPCR 對(duì)74 對(duì)口腔鱗癌組織及癌旁正常組織樣本進(jìn)行COL11A1-208 的表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)COL11A1-208 在口腔鱗癌組織中顯著高表達(dá)；雖然有22 例癌組織的COL11A1-208 表達(dá)相比正常組織無明顯高表達(dá)或呈低表達(dá)，但可能與腫瘤的異質(zhì)性有關(guān)，腫瘤組織的分化程度、患者的個(gè)體差別等都會(huì)影響腫瘤內(nèi)基因的表達(dá)水平。此外，COL11A1-208 的表達(dá)水平與臨床分期有關(guān)：早期的口腔鱗癌組織內(nèi)COL11A1-208 的表達(dá)水平顯著低于晚期癌組織，提示COL11A1-208 作為具有臨床特性的lncRNA，具有一定的臨床應(yīng)用潛力。本研究初步評(píng)價(jià)了COL11A1-208 作為診斷口腔鱗癌患者生物標(biāo)志物的可行性，采用ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)其AUC 為0.702，靈敏度較高（87.8%），提示COL11A1-208 在口腔鱗癌診斷上有一定的價(jià)值；但其診斷特異度較低（54.1%）。本研究將癌旁組織內(nèi)的基因表達(dá)水平作為正常組織納入ROC 評(píng)價(jià)體系，由此得到的結(jié)論僅有一定的參考價(jià)值，還需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。對(duì)患者進(jìn)行隨訪研究發(fā)現(xiàn)，COL11A1-208高表達(dá)組患者的3 年生存率低于低表達(dá)組，該結(jié)果提示COL11A1-208 可能與口腔鱗癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。關(guān)于COL11A1-208 作為早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的潛能，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量、延長(zhǎng)隨訪時(shí)間并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)深入研究。再者，鑒于COL11A1-208 與COL11A1 在口腔鱗癌組織表達(dá)和臨床特征上的重要意義，兩者之間的因果及調(diào)控關(guān)系需要在今后繼續(xù)研究。

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