郭子立,夏駿杰,韓 寧,顧金蘋,蘇 鳳,梁現(xiàn)蕊,謝媛媛

(浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

貓須草Clerodendranthusspicatus(Thunb.) C.Y.Wu,別名貓須公、腎茶,為唇形科腎茶屬植物貓須草的干燥全草,主產(chǎn)于馬來西亞、印度尼西亞、菲律賓、緬甸和泰國等東南亞國家,以及我國的福建、臺(tái)灣、云南、廣西和海南等地[1]。現(xiàn)代研究報(bào)道貓須草主要含有萜類、黃酮類和酚酸類等化學(xué)成分[2-4],具有利尿排石、抗炎抗菌、抗氧化、降壓和降糖等藥理作用[5-11]。臨床研究表明:貓須草對尿路結(jié)石[12]、腎炎[13]和急性膀胱炎[14]均有特殊療效,被譽(yù)為“國際利尿化石藥”。

近年來,發(fā)展起來的中藥指紋圖譜相對于以主要成分作為指標(biāo)控制中藥材質(zhì)量的方法,具有系統(tǒng)性、整體性和穩(wěn)定性等特點(diǎn)[15-18],能較全面地反映中藥材或中藥制劑的內(nèi)在質(zhì)量。有學(xué)者通過高效液相色譜(HPLC)技術(shù)研究了貓須草的指紋圖譜[19-21],但由于近年來,超高效液相色譜(UPLC)技術(shù)的高速發(fā)展,與傳統(tǒng)的HPLC方法相比,它可以提高液相色譜分離的有效性,提高分離度,靈敏度以及分析速度[22-23],UPLC的這些優(yōu)勢使其成為分析的強(qiáng)大工具。基于此,本實(shí)驗(yàn)對不同來源的貓須草進(jìn)行了UPLC指紋圖譜研究,并對其抗氧化活性進(jìn)行了研究,以期初步探尋其抗氧化物質(zhì)基礎(chǔ),并為更好地控制貓須草質(zhì)量提供一定依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀(美國Waters公司);Mettler Toledo XS205分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司);KH5200DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);島津UV2550紫外分光光度計(jì)(日本島津公司);R-215旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司);純水機(jī)(美國Thermo公司)。

1.2 試 藥

DPPH和維生素C(上海麥克林生化科技有限公司);咖啡酸和迷迭香酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%,上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司);丹酚酸B、甜橙黃酮和佩蘭素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥97%,四川成都維克奇生物科技有限公司;乙腈和甲醇(色譜級,德國Merck公司);甲酸(色譜級,上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司);水為超純水(實(shí)驗(yàn)室自制);其余試劑均為分析級。

貓須草試驗(yàn)樣品(編號(hào)S1～S8)經(jīng)浙江農(nóng)林大學(xué)藥學(xué)院周愛存講師鑒定為唇形科植物貓須草Clerodendranthusspicatus的干燥全草,具體信息見表1。

2 方 法

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 溶液配制

對照品溶液:精密稱取咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、甜橙黃酮和佩蘭素5種對照品適量,用甲醇或水溶解后,用甲醇溶液定容至刻度,即得。使用前儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中。

供試品溶液:精密稱取貓須草粉末0.2 g置于具塞錐形瓶中,精密加入無水乙醇14 mL,45 ℃下超聲20 min。放冷后,過濾,減壓去除溶劑后,將殘?jiān)苡? mL甲醇并過0.22 μm PTFE膜,即得。

2.1.2 色譜條件

Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色譜儀配有PDA二極管陣列檢測器,Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱(2.1×50 mm,1.7 μm),流動(dòng)相為0.1%甲酸水(A)-甲醇(B),梯度洗脫程序?yàn)?0～2 min,5%B;2～5 min,5%～25%B;5～10 min,25%B;10～16 min,25%～40%B;16～22 min,40%B;22～28 min,40%～60%B;28～30 min,60%～5%B,流速為0.2 mL/min,柱溫60 ℃,檢測波長323 nm,進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.1.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn):按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液(隨機(jī)選取S5批樣品),連續(xù)進(jìn)樣6次,計(jì)算共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間。

重現(xiàn)性試驗(yàn):按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液(隨機(jī)選取S5批樣品),重復(fù)制備6份供試品溶液,按照上述色譜條件分別進(jìn)樣,計(jì)算共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間。

穩(wěn)定性試驗(yàn):按照2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液(隨機(jī)選取S5批樣品),分別在0,3,6,9,12 h不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣,計(jì)算共有峰的相對峰面積和相對保留時(shí)間。

2.1.4 樣品測定

分別依次精密吸取1.0 μL供試品注入U(xiǎn)PLC,進(jìn)樣,并按照2.1.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定,得8批藥材的UPLC色譜圖。

2.2 抗氧化活性測定

分別取貓須草粉末1.0 g,精密稱定,置于磨口錐形瓶中,加入20 mL溶劑,50 ℃下超聲60 min。放冷后,過濾,減壓去除溶劑后,將殘?jiān)占瘋溆谩?/p>

參照文獻(xiàn)[24-25],將樣品用90%乙醇配制成一系列質(zhì)量濃度,取2 mL不同濃度的樣品液加入2 mL DPPH的乙醇溶液(0.025 mmol/L)中,搖勻后避光保存1 h后,測定各樣品在517 nm的吸光度,清除率計(jì)算公式為

式中:Asample為2 mL樣品+2 mL DPPH溶液的吸光度;Ablank為2 mL樣品+2 mL溶劑的吸光度;Acontrol為2 mL溶劑+2 mL DPPH溶液的吸光度。分別測得8批貓須草樣品的DPPH清除率,重復(fù)3次,取平均值計(jì)算。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

8批貓須草藥材的指紋圖譜被得到,其中標(biāo)定了15個(gè)特征共有峰。通過與對照品溶液的保留時(shí)間和UV光譜圖比較(圖1),確定峰1,4,6,11和13,分別對應(yīng)為咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B、甜橙黃酮和佩蘭素。由于色譜峰4(迷迭香酸)在所有樣品中的峰面積最大,且保留時(shí)間合適、分離度良好,故選擇峰4為參照峰并規(guī)定其保留時(shí)間和峰面積為1,分別求出其他組分的相對保留時(shí)間和相對峰面積,并計(jì)算RSD,結(jié)果見表2。

1—咖啡酸;4—迷迭香酸;6—丹酚酸B;11—甜橙黃酮;13—佩蘭素。圖1 混合對照品和樣品的UPLC譜圖Fig.1 The UPLC chromatograms of mixed standards and sample extract

表2 UPLC指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 精密度試驗(yàn)

各主要色譜峰相對峰面積的RSD在0.42%～4.55%。相對保留時(shí)間的RSD在0.10%～0.81%,說明儀器精密度良好。

3.1.2 重現(xiàn)性試驗(yàn)

各主要色譜峰相對峰面積的RSD在0.62%～3.65%。相對保留時(shí)間的RSD在0.40%～1.85%,說明方法重現(xiàn)性良好。穩(wěn)定性試驗(yàn):各主要色譜峰相對峰面積的RSD在0.57%～3.29%。相對保留時(shí)間的RSD在0.07%～0.68%,說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定,儀器穩(wěn)定性良好。

3.2 相似度評價(jià)分析

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)(2004A)》對各樣品色譜圖的原始數(shù)據(jù)文件進(jìn)行分析,計(jì)算各色譜圖的整體相似度見圖2和表3。結(jié)果表明:不同采集時(shí)間和采集地點(diǎn)的貓須樣品中,除了S5樣品相似度為0.817外,其余樣品均具有良好的相似度(均在0.912～1.000),其中S1,S2,S3,S4,S6,S7與對照圖譜的相似度高達(dá)0.959以上,得出貓須草總體相似度較高,說明本次實(shí)驗(yàn)所采集的貓須草質(zhì)量穩(wěn)定,個(gè)別批次相似度較低,可能是與存放時(shí)間過長有關(guān)。

圖2 8批貓須草樣品色譜峰匹配圖Fig.2 UPLC match chromatograms of 8 batches of Clerodendranthus spicatus

表3 貓須草提取物的相似度評價(jià)結(jié)果

3.3 抗氧化結(jié)果

對不同提取溶劑(水、25%乙醇、50%乙醇、75%乙醇和乙醇)的貓須草提取物進(jìn)行了DPPH自由基的清除試驗(yàn),結(jié)果得出不同提取溶劑的提取物對DPPH自由基均具有清除作用,且清除率的大小隨濃度的增加而增大,并以50%乙醇提取物的清除自由基效果最好,經(jīng)過SPSS 20.0軟件分析得到其半數(shù)清除質(zhì)量濃度EC50為(7.869±1.356) μg/mL,其余提取物質(zhì)量濃度EC50值分別為水提物(9.934±0.950) μg/mL、25%乙醇提取物(9.077±1.312) μg/mL、75%乙醇提取物(9.232±0.916) μg/mL、乙醇提取物(14.070±1.536) μg/mL。

隨后,對不同批次貓須草50%的乙醇提取物進(jìn)行了DPPH清除試驗(yàn),并計(jì)算各批次的EC50值。從結(jié)果可以看出:S5的EC50為(8.935±0.716) μg/mL比其他批次的貓須草樣品稍高,即S1的EC50為(6.890±0.666) μg/mL、S2的EC50為(7.856±0.624) μg/mL、S3的EC50為(8.199±0.605) μg/mL、S4的EC50為(6.850±0.241) μg/mL、S6的EC50為(8.121±0.268) μg/mL、S7的EC50為(7.044±0.871) μg/mL、S8的EC50為(7.134±0.787) μg/mL、Vc的EC50為(1.252±0.525) μg/mL,這也與指紋圖譜的相似度評價(jià)一致,進(jìn)一步說明存放時(shí)間越久,貓須草的藥效作用可能會(huì)越弱。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)所建立的貓須草藥材的UPLC指紋圖譜的分析方法,精密度、重復(fù)性、分離度及穩(wěn)定性良好,通過比較確定了15個(gè)共有峰,并通過對照品比對指認(rèn)了5個(gè)峰。通過相似度評價(jià),分析貓須草UPLC指紋圖譜有一定的差別?？紤]到中藥成分復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)還結(jié)合了體外抗氧化活性的分析,來輔助評價(jià)不同批次貓須草的質(zhì)量評價(jià)。結(jié)果表明:對于不同采摘地點(diǎn)和采摘時(shí)間來說,存放時(shí)間的長短對貓須草藥材的質(zhì)量影響較大,后續(xù)可以通過改變存放條件進(jìn)一步研究存放條件對貓須草藥材質(zhì)量的影響。本研究可為貓須草藥材的鑒別、質(zhì)量控制提供一定的科學(xué)依據(jù)。