方小聰,鐘建榮,楊善巖,徐昊澤,陳穩(wěn)竹

(1.眼力健(杭州)制藥有限公司,浙江 杭州 310018;2.杭州民生健康藥業(yè)有限公司,浙江 杭州 311100;3.杭州民生藥業(yè)有限公司,浙江 杭州 311100)

“酵素(Enzyme)”在舊時(shí)也指酶類物質(zhì),現(xiàn)在多指一些發(fā)酵產(chǎn)物,如市面上常見的植物酵素、酵素菌肥和環(huán)保酵素等,都屬于后者。其中的植物酵素,是利用益生菌對(duì)果蔬等植物來源的底物進(jìn)行發(fā)酵,得到的一種富含生物酶、維生素及次生代謝產(chǎn)物的微生物產(chǎn)品[1-2]。如果是采用人工接種的益生菌發(fā)酵制備的酵素,稱為人工酵素;如果采用底物自帶益生菌或環(huán)境含有的益生菌發(fā)酵制備的酵素,則稱為天然酵素[3]。前者發(fā)酵周期短,制備迅速,且過程可控,不易被雜菌污染;后者發(fā)酵周期長,過程不可控,容易被雜菌污染。當(dāng)前酵素及益生菌類產(chǎn)品是市場的熱門,如果利用益生菌對(duì)竹筍進(jìn)行發(fā)酵處理,制成含有活性益生菌的竹筍酵素,可實(shí)現(xiàn)活性益生菌與竹筍的結(jié)合,同時(shí)可增加其風(fēng)味。益生菌在主要定植于腸道,具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、促進(jìn)消化吸收、提高機(jī)體免疫力等作用[4-6],產(chǎn)生的細(xì)菌素還有抑制有害菌的作用[3,7-9]。但竹筍中纖維素較多,而普通益生菌又不能降解纖維素,所以制備的竹筍酵素往往口感較差。

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)既產(chǎn)芽孢,又產(chǎn)乳酸,是一種“有孢子的乳酸菌”。該菌不僅具有普通乳酸菌(如乳桿菌、雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌等)的保健功效,還具有較強(qiáng)抗逆性(如耐熱性、耐酸性和耐膽堿等)[10],且對(duì)腸道致病菌具有較強(qiáng)的抑制作用[11]。衛(wèi)計(jì)委2016年第6號(hào)公告,將凝結(jié)芽孢桿菌列入《可用于食品的菌種名單》。有研究表明:凝結(jié)芽孢桿菌在產(chǎn)生乳酸的同時(shí),可代謝產(chǎn)生纖維素酶[12],可有效降解纖維素;能合成如維生素、氨基酸和短鏈脂肪酸等;還能代謝產(chǎn)生對(duì)腸道炎癥有治療作用的抑菌物質(zhì),如“凝結(jié)素”、L-乳酸和一些低分子胺類物質(zhì)等[13],是制備竹筍酵素的理想發(fā)酵菌種。利用凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵結(jié)合真空冷凍干燥技術(shù)制備竹筍酵素,不但克服了天然竹筍口感和風(fēng)味差的缺陷,而且富含益生菌和生物活性物質(zhì),使其變成一種安全營養(yǎng)的功能食品配料。在此,以分離篩選到的一株凝結(jié)芽孢桿菌MSJK001為菌種,通過Minitab 16和Design-Expert 7.0.3軟件對(duì)竹筍的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化,確定了發(fā)酵過程中的關(guān)鍵參數(shù)。

1 材料及方法

1.1 材 料

土壤樣品,采集于浙江省杭州市的一塊農(nóng)田表層(0～10 cm);新鮮竹筍,采用新鮮毛竹筍,采自浙江省湖州市安吉縣;PCR試劑盒,PCR產(chǎn)物純化試劑盒,pMDl9-T simple vectorE.coliDH5α均購于TaKaRa公司;人工胃液(胃蛋白酶活性3 000 U/mg,pH=1.5±1)、人工腸液(胰蛋白酶活性250 U/mg,pH=6.8±1)購自Sigma公司;L-乳酸檢測(cè)試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 富集與分離

采用GYP培養(yǎng)基對(duì)預(yù)處理土壤進(jìn)行富集培養(yǎng),采用(MRS培養(yǎng)基)分離潛在的L-乳酸產(chǎn)生菌。取一個(gè)250 mL的三角瓶,加入100 mL GYP培養(yǎng)基,將約10 g的土壤樣品加入,搖勻,然后置于100 ℃處理15 min,于30 ℃,150 r/min孵育24 h。取1 mL的培養(yǎng)物用滅菌蒸餾水進(jìn)行梯度稀釋,稀釋液分別涂布于MRS培養(yǎng)基(添加CaCO3質(zhì)量濃度20 g/L)平板,置于30 ℃條件下培養(yǎng)2～3 d。選擇有周圍有透明圈的單菌落,進(jìn)一步進(jìn)行平板劃線分離。

1.3 菌種鑒定

利用《伯杰氏細(xì)菌手冊(cè)》進(jìn)行菌種的形態(tài)鑒定,通過16S rDNA序列比對(duì)進(jìn)行菌種的分子鑒定。16S rDNA引(前導(dǎo)鏈:5′-GACGAACGCTTGCGGCGTGC-3′,后隨鏈:5′-CCTTCCAATACGGAGGGTGC-3′)物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR體系參照PCR試劑盒說明書進(jìn)行。PCR程序:95 ℃預(yù)變性6 min;95 ℃變性45 s,60 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30次循環(huán);72 ℃延伸15 min。PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),分別回收目的片段,并T/A克隆至pMDl9-T simple vector,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,經(jīng)藍(lán)白斑篩選獲得轉(zhuǎn)化子,測(cè)序由上海華大基因科技有限公司完成。目標(biāo)菌株的16S rDNA序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得登錄號(hào)MK402079。該序列經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫Blast比對(duì)分析,確定其親緣關(guān)系。

1.4 發(fā) 酵

保藏菌種于MRS斜面培養(yǎng)基45 ℃活化18 h;用無菌水洗下菌種,并將其OD600調(diào)整為1,即為菌懸液;按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的接種量,轉(zhuǎn)接于MRS液體培養(yǎng)基,于45 ℃,150 r/min培養(yǎng)18 h,即為液體菌種。

新鮮毛竹筍,除雜切成1 cm長(或見方)的小段(或小塊),按固液比1∶6加無菌水,勻漿,制備竹筍勻漿液。用無菌水和麥芽糊精將竹筍勻漿液的相對(duì)密度調(diào)整為1.2,再用無菌水和葡萄糖漿將其糖度調(diào)整到1～2,最后將其pH調(diào)整為5～8。

將液體菌種按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%～14%的接種量,轉(zhuǎn)接于上述竹筍勻漿液,然后將其裝入500 mL的三角瓶(裝量2/3),密封,于25～50 ℃,100 r/min,發(fā)酵24～48 h。

1.5 發(fā)酵液后處理

發(fā)酵結(jié)束后,每100 mL發(fā)酵產(chǎn)物中添加10 g海藻糖,混勻溶解,于真空度15 Pa,溫度-60 ℃條件下冷凍干燥;真空冷凍干燥結(jié)束后,產(chǎn)物用粉碎機(jī)粉碎至20～40目。

1.6 檢測(cè)方法

1.6.1 益生菌檢測(cè)

益生菌活菌數(shù)按照GB 4789.35—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》測(cè)定。

1.6.2 pH值測(cè)定

首先將5.0 g(液體試樣為5 mL)樣品加45 mL蒸餾水制成稀釋液,然后測(cè)定pH值。

1.6.3 乳酸測(cè)定

L-乳酸測(cè)定按照L-乳酸檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.4 溶解性測(cè)定

將樣品加入25 ℃的純化水中,攪拌使其溶解,2 000 r/min,離心10 min;棄沉淀,上清液冷凍干燥處理(真空度15 Pa,溫度-60 ℃)。溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(上清液凍干物質(zhì)量/待測(cè)樣品質(zhì)量)×100%,樣品均以干重計(jì)。

1.6.5 抗逆性測(cè)定

取2 g樣品,溶于37 ℃的人工胃液/人工腸液中100 r/min攪拌30 min。以生理鹽水替代人工胃液/人工腸液,作為對(duì)照;于8 000 r/min,離心20 min,棄上清,沉淀用生理鹽水洗滌3次;沉淀用生理鹽水梯度稀釋;選擇2～3個(gè)合適的稀釋度,每個(gè)稀釋度吸取100 μL樣品分別加入到培養(yǎng)皿中,傾入冷卻至50 ℃左右的MRS培養(yǎng)基約20 mL,輕輕旋轉(zhuǎn)搖勻,靜置凝固,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～20 h計(jì)數(shù)?？鼓嫘酝ㄟ^率=(試驗(yàn)組/對(duì)照組)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)軟件Minitab 16進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析,考察各因素的顯著差異,進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn),確定顯著性的最佳值區(qū)域,通過Design-Expert 7.0.3軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 菌株形態(tài)及生理生化特征

如圖1所示,分離到的一株L-乳酸產(chǎn)生菌(命名為MSJK001),菌體大小為(0.7～0.8) μm×(3～5) μm,革蘭氏染色呈陽性,無鞭毛,桿狀,多數(shù)單獨(dú)存在,少數(shù)排成短鏈;芽孢端生,大小約0.55 μm×1.1 μm。該菌株在MRS培養(yǎng)基(添加CaCO3質(zhì)量濃度20 g/L)上的菌落直徑為2.0～2.5 mm,周圍有溶鈣圈,邊緣整齊,表面有光澤,不透明,質(zhì)地軟。

圖1 菌株MSJK001溶鈣圈及芽孢染色圖Fig.1 Dissolved calcium circle and spore staining of strain MSJK001

生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表1所示,革蘭氏染色、VP試驗(yàn)、淀粉水解和酪蛋白分解等均呈陽性,而檸檬酸鹽利用、甲基紅試驗(yàn)和吲哚產(chǎn)生等均呈陰性,比較發(fā)現(xiàn)菌株MSJK001生理生化特征與凝結(jié)芽孢桿菌最為相似。

表1 菌株MSJK001生理生化特征

2.2 菌株MSJK001的16S rDNS序列比對(duì)

將菌株MSJK001的16S rDNS序列與GenBank公布的序列進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)該菌株與凝結(jié)芽孢桿菌16S rDNA序列(登錄號(hào)DQ347840.1)的同源性最高,達(dá)到99%。通過綜合形態(tài)特征、生理生化分析及序列分析比對(duì),可以認(rèn)為菌株MSJK001為凝結(jié)芽孢桿菌的1個(gè)亞種,可正式將其定名為凝結(jié)芽孢桿菌MSJK001。凝結(jié)芽孢桿菌MSJK001的16S rDNA序列提交NCBI的GenBank,獲得登錄號(hào)為No.MK402079。

2.3 影響因素顯著性分析

通過Plackett-Burman試驗(yàn)對(duì)影響因素進(jìn)行顯著性分析。試驗(yàn)選取5個(gè)因素進(jìn)行考察,通過對(duì)比各因素兩水平間差異與整體差異來分析因素的顯著性,所選因素及水平分別為糖度(1.0%,1.5%)、初始pH(6,7)、接種量(4%,8%)、溫度(35,40 ℃)和時(shí)間(24,36 h),采用N=12試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn),借助統(tǒng)計(jì)軟件Minitab 16進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。因素效應(yīng)Pareto圖見圖2,竹筍凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵的顯著性影響因素(置信度大于95%)有接種量、溫度和初始pH,這3個(gè)顯著因素對(duì)發(fā)酵液的活菌數(shù)的影響可以由方程Y看出:Y=-3.705-0.067A+0.010 28B+0.088 3C+0.048 7D+0.256 7E,R2=0.840 7。

A—糖度;B—時(shí)間;C—接種量;D—溫度;E—初始pH。圖2 因素效應(yīng)Pareto圖Fig.2 Pareto picture of factorial effect

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

由影響因素顯著性分析可知:接種量、溫度和初始pH為顯著性影響因素。對(duì)這3個(gè)顯著性因素進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化,確定其最佳值。在響應(yīng)面優(yōu)化中,要真實(shí)的反應(yīng)真實(shí)情形并建立有效的擬合方程,需要接近因素的最佳值區(qū)域,這往往通過最陡爬坡試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)[14-15]。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2,其中5號(hào)試驗(yàn)中發(fā)酵液活菌數(shù)最高,可達(dá)4.42×109CFU/mL,即對(duì)應(yīng)的接種量、溫度和初始pH值3個(gè)因素在最佳值附近,可據(jù)此進(jìn)一步對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

2.5 發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.5.1 回歸模型擬合及方差分析

采用Box-Behnken試驗(yàn),對(duì)影響發(fā)酵液活菌數(shù)的顯著因素進(jìn)行三因素三水平的15組試驗(yàn)。因素水平設(shè)置分別為接種量(10%,12%,14%),溫度(44,48.5,53 ℃),初始pH(6.5,7,7.5)。對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析,擬合得到多元回歸模型:發(fā)酵液的活菌數(shù)Y=4.55+0.092X1+0.079X2+0.014X3+0.05X1X2-0.06X1X3+0.48X2X3-0.36X12-0.81X22-0.42X32。方差分析顯示:接種量、初始pH及溫度對(duì)發(fā)酵液活菌數(shù)有顯著的正效應(yīng),模型p=0.009 4,小于0.05,顯著;矢擬項(xiàng)的p=0.146 5,大于0.05,不顯著;決定系數(shù)R2=0.949 5,大于0.9,綜上所述回歸模型擬合程度良好。

2.5.2 響應(yīng)面交互作用優(yōu)化與分析

為進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用并確定最優(yōu)點(diǎn),利用Design-Expert 7.0.3軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行分析,圖3為部分響應(yīng)面分析立體圖和等高線圖。軟件分析結(jié)果表明:當(dāng)接種量為9.1%、溫度為48.9 ℃及初始pH為6.8時(shí),發(fā)酵液的活菌數(shù)預(yù)測(cè)最高值為4.549 56×109CFU/mL。綜合考慮,將最佳條件定為接種量9%、溫度49 ℃及初始pH 6.8。

圖3 活菌數(shù)的響應(yīng)面3D及等高線圖Fig.3 Plots and 3D response surface of VIC values

2.5.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性,用優(yōu)化后的條件(接種量9%、溫度49 ℃及初始pH 6.8)進(jìn)行試驗(yàn),發(fā)酵液中的活菌數(shù)為4.37×109CFU/mL,基本吻合模型預(yù)測(cè)最大值,說明模型合理有效。

2.6 產(chǎn)物特性

發(fā)酵液經(jīng)真空冷凍干燥處理,做成的竹筍酵素粉富含活性凝結(jié)芽孢桿菌,活菌數(shù)可達(dá)3.8×1011CFU/g,在水中的溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)為56.8%。竹筍酵素粉中含有以乳酸為主的大量的有機(jī)酸,其中L-乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)0.5%。人工胃液、人工腸液抗逆性測(cè)試結(jié)果表明了凝結(jié)芽胞桿菌通過率為35.6%。

3 結(jié) 論

以凝結(jié)芽孢桿菌對(duì)竹筍進(jìn)行發(fā)酵,通過Plackett-Burman試驗(yàn)及Box-Behnken試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳的發(fā)酵條件。用優(yōu)化后的條件進(jìn)行發(fā)酵和冷凍干燥,得到了理想的竹筍酵素粉活菌數(shù)、溶解質(zhì)量分?jǐn)?shù)和抗逆性測(cè)試結(jié)果凝結(jié)芽胞桿菌通過率。凝結(jié)芽孢桿菌可與其他益生菌進(jìn)行竹筍的聯(lián)合發(fā)酵,也可在發(fā)酵前利用纖維素酶對(duì)竹筍進(jìn)行酶解或在發(fā)酵過程中接入纖維素降解菌,進(jìn)一步改善竹筍的溶解性。結(jié)果表明:益生菌發(fā)酵竹筍酵素粉將益生菌的益生效果與竹筍的健康功效合二為一,并改善了竹筍的營養(yǎng)結(jié)構(gòu),使之更符合現(xiàn)代人群的健康需求,同時(shí)也為益生菌的利用及酵素產(chǎn)品的開發(fā)提供了新的思路。