汪雨晨，陶陽，李丹丹，韓永斌*，姜小三，姜應兵

1(南京農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，江蘇 南京，210095)2(南京農(nóng)業(yè)大學 泰州研究院，江蘇 泰州，225300) 3(南京曉莊學院 幼兒師范學院，江蘇 南京， 211171)

超聲波是一種頻率超過人類聽覺上限(20 kHz)的聲波，常根據(jù)頻率不同分為低頻超聲波和高頻超聲波[1]。低頻超聲波的頻率為20～100 kHz，其中具有高能量的低頻超聲波因能產(chǎn)生強大的剪切力和機械力，可破壞物質(zhì)結(jié)構，加速傳質(zhì)和化學反應而常用于食品加工領域[2]。

關于超聲波在微生物領域的應用，最早是利用高強度超聲波對微生物的致死作用，將其用于非熱殺菌領域，而將超聲波加載于微生物發(fā)酵過程中的研究開展的較晚。近年來，越來越多的研究證實低頻低強度超聲波可促進微生物的生長，提高目的代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。DAI等[3]發(fā)現(xiàn)在釀酒酵母的生長遲滯期采用頻率為28 kHz，強度為140 W/L超聲作用1 h，可使釀酒酵母的生物量提升127%。AVHAD等[4]的研究表明，在頻率為25 kHz，強度為160 W，作用時間為10 min的超聲條件下，芽孢桿菌的纖維蛋白分解酶的產(chǎn)量比未超聲處理組高出1.48倍左右。而低頻低強度超聲波對微生物發(fā)酵的這一輔助作用，主要歸因于其產(chǎn)生的物理化學效應對細胞的損傷較小，可使微生物處于一種“亞致死”狀態(tài)，增強了細胞膜的通透性，改善了傳質(zhì)，從而提高了發(fā)酵效率[2,5]。

白果是銀杏科銀杏屬銀杏樹的種子，不僅含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，還含有一些特異性生物活性物質(zhì)，包括銀杏酸、銀杏萜內(nèi)酯以及各種酚類化合物[6]。其中，銀杏萜內(nèi)酯具有很強的藥理活性，對心腦血管和神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定的防治作用[7]。而銀杏酸因具有潛在的免疫毒性、神經(jīng)毒性和細胞毒性[8]，為白果及其制品的食用安全性帶來了隱患。

本實驗室前期選用了3種乳酸菌，分別為嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵白果汁，就乳酸菌在白果汁中的發(fā)酵特性展開研究。研究表明，3株乳酸菌在白果汁中長勢良好，可充分利用基質(zhì)中的糖類產(chǎn)生大量乳酸，并可通過降解白果汁中的銀杏酸以及富集銀杏內(nèi)酯和酚類物質(zhì)來提高白果汁的食用安全性和營養(yǎng)價值[9]。若在乳酸菌發(fā)酵白果汁過程中輔以低頻低強度超聲處理，或可增強乳酸菌發(fā)酵對白果汁所產(chǎn)生的積極影響。因此，本實驗在前期研究的基礎上，選用了活力較強，代謝較旺盛的植物乳桿菌作為白果汁的發(fā)酵菌株，并以非超聲處理的植物乳桿菌發(fā)酵白果汁作為對照，研究了低頻低強度超聲波對植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中菌體生長及代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白果(品種：大佛指)，由江蘇省泰州市杏潤食品有限公司提供；植物乳桿菌(LactobacillusplantarumBNCC194165)，購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，以凍干粉的形式貯存；MRS液體培養(yǎng)基,上海博微生物科技有限公司；MRS瓊脂培養(yǎng)基,上海盛思生化科技有限公司；α-淀粉酶(4 000 U/g)、糖化酶(100 000 U/g)、銀杏酸標準品、銀杏萜內(nèi)酯標準品、酚類物質(zhì)標準品(色譜純)，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(色譜純),美國天地有限公司；冰乙酸(色譜純),上海麥克林生化科技有限公司；四氫呋喃(色譜純),上海阿拉丁生化科技有限公司；其他試劑均為分析純。

VCX130超聲波細胞破碎儀,美國nicolet公司；LDZF-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1FD單人單面凈化工作臺,蘇州凈化設備有限公司；PYX-DHS.500BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進醫(yī)療器械有限公司；RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機,上海安亭科學儀器廠；UV5100B，紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司；L-8900全自動氨基酸分析儀,日本日立高新技術公司；LC-2010A高效液相色譜儀,日本島津公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 白果汁的制備

在ZHANG等[10]方法的基礎上進行一定的修改。去除白果的外殼和內(nèi)種皮，洗凈后與純凈水按照1∶5(g∶mL)打漿。為了提高出汁率和可溶性糖的含量，加入20 U/g α-淀粉酶和30 U/g糖化酶(均以白果的質(zhì)量計)，于60 ℃進行液化和糖化處理2 h。酶解完成后，通過4 000 r/min離心20 min去除不溶物，并采用90 ℃水浴殺菌20 min。待果汁冷卻后，于無菌操作臺上進行分裝，每500 mL滅菌的錐形瓶中加入300 mL白果汁。

1.2.2 種子液的制備

將植物乳桿菌凍干粉置于MRS肉湯培養(yǎng)基中進行活化復壯，并將其接種至試管斜面。制備種子液時，從試管斜面上取1環(huán)，接種至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃靜置培養(yǎng)至菌體濃度達9.0 lg CFU/mL。

1.2.3 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁

將種子液以2%的接種量接種至滅菌白果汁中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h。在發(fā)酵第0、4、8、12、24、36、48 h，在超凈臺內(nèi)將超聲波設備(20 kHz)的探頭(直徑為10 mm)伸入液面以下1 cm處，超聲處理接種后的白果汁。超聲強度分別為58.9、93.6和 120.8 W/L，超聲時間為1 min，處理模式為5 s開5 s關。因超聲時間較短，超聲波熱效應對發(fā)酵液的溫度不產(chǎn)生顯著影響，因此，超聲過程中未對發(fā)酵液進行控溫處理。每次超聲之前取樣進行相應的微生物及理化指標的測定。除微生物指標外，其余指標均取離心后(10 000 r/min，15 min)的發(fā)酵上清液進行測定。

1.2.4 活菌數(shù)的測定

采用平板計數(shù)法[11]進行測定。樣品經(jīng)過生理鹽水梯度稀釋后，根據(jù)其含有的活菌數(shù)，選擇2～3個連續(xù)的稀釋梯度，每個稀釋度取0.1 mL樣液置于滅菌培養(yǎng)皿中，倒入MRS瓊脂培養(yǎng)基后搖勻，待培養(yǎng)基冷卻凝固后于37 ℃培養(yǎng)36～48 h。選取菌落數(shù)在30～300 CFU的平板進行計數(shù),結(jié)果以lg CFU/mL表示。

1.2.5 pH的測定

利用精密pH計直接測定。

1.2.6 有機酸的測定

采用高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法對樣品中有機酸的組成和含量進行分析。色譜條件參照LIMA等[12]的報道并稍加修改。色譜柱為Agilent TC-C18柱(250 mm × 4.6 mm,5 μm)；流動相為0.08 mmol/L KH2PO4水溶液(pH用H3PO4調(diào)至2.9)；流速0.7 mL/min；柱溫30 ℃；紫外檢測波長210 nm；進樣體積20 μL。離心上清液過0.22 μm水系濾膜后直接進樣分析。通過有機酸標準品獲得保留時間和標準曲線對發(fā)酵液中有機酸進行定性和定量,結(jié)果以g/L表示。

1.2.7 單體糖的測定

參照VERVOORT等[13]的方法，通過高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-evaporative light scattering detector，HPLC-ELSD)法對樣品中單體糖的種類及含量進行測定。采用安捷倫1200系列液相色譜儀，外部連接Alltech 3300蒸發(fā)光散射檢測器。色譜柱為Prevail carbohydrate ES column(250 mm × 4.6 mm，5 μm)，連接一個Prevail C18柱(7.5 mm × 4.6 mm，5 μm)作為保護柱。柱溫30 ℃；流動相為V(乙腈)∶V(水)=75∶25；流速1 mL/min；漂移管溫度80 ℃；氮氣流速1.5 L/min。進樣量10 μL。采用標準品獲得保留時間和標準曲線對發(fā)酵液中單體糖進行定性和定量，結(jié)果表示為g/L。

1.2.8 游離氨基酸的測定

采用全自動氨基酸分析儀分析了樣品中游離氨基酸的種類及含量。進樣前，將發(fā)酵上清液與4%(質(zhì)量分數(shù))的磺基水楊酸溶液等比例混合，并在4 ℃靜置1 h，以沉淀樣品中的蛋白和多肽[14]。之后于15 000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm水系濾膜后進樣分析，結(jié)果以mg/L表示。

1.2.9 銀杏酸的測定

1.2.9.1 銀杏酸的提取純化

在HE等[15]方法的基礎上，采用液液萃取法提取樣品中的銀杏酸。取50 mL樣品通過減壓真空濃縮法濃縮至5 mL。然后與等體積的甲醇混合，超聲提取(40 kHz，250 W)30 min后，離心收集上清液。上清液中的甲醇通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除后，加入正己烷萃取3次，每次10 mL。合并有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘渣用甲醇溶解并定容至1 mL，用0.45 μm有機濾膜過濾后采用HPLC進行測定。

1.2.9.2 銀杏酸的HPLC分析

HPLC條件在田曉清等[16]的基礎上稍作修改。采用Waters XTerra MS-C18柱(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)，在310 nm下進行測定。流動相為V(甲醇)∶V(體積分數(shù)為3%冰乙酸)=92∶8；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；進樣體積20 μL。精密稱取銀杏酸標準品溶解于甲醇中，梯度稀釋成不同濃度的溶液并進樣分析。以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線。比對樣品和標準品的色譜圖，根據(jù)出峰時間確定樣品中銀杏酸的種類，并利用標準曲線計算樣品中不同銀杏酸的含量，結(jié)果以mg/L表示。

1.2.10 銀杏萜內(nèi)酯的測定

1.2.10.1 銀杏萜內(nèi)酯的提取純化

參考DUBBER等[17]的方法，采用液液萃取法提取樣品中的銀杏萜內(nèi)酯。其中甲醇提取部分與銀杏酸甲醇提取步驟一致，待去除上清液中的甲醇后，加入乙酸乙酯萃取3次，每次10 mL。合并有機相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干，殘渣用甲醇溶解并定容至1 mL，用0.45 μm有機濾膜過濾后采用HPLC-ELSD進行測定。

1.2.10.2 銀杏萜內(nèi)酯的HPLC-ELSD分析

色譜條件參照KAUR等[18]并稍作修改。采用Krosmail 100-C18柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)；流動相為V(水)∶V(甲醇)∶V(四氫呋喃)=65∶25∶10；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃，蒸發(fā)光檢測器的漂移管溫度為90 ℃；N2壓力設置在350 kPa左右；進樣體積20 μL。精密稱取銀杏內(nèi)酯標準品溶解于甲醇中，梯度稀釋成不同濃度的溶液并進樣分析。以峰面積的對數(shù)為縱坐標，銀杏內(nèi)酯濃度的對數(shù)為橫坐標繪制標準曲線。比對樣品和標準品的色譜圖，根據(jù)出峰時間確定樣品中銀杏內(nèi)酯的種類，并利用標準曲線計算樣品中不同銀杏內(nèi)酯的含量，結(jié)果以mg/L表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗設置3次重復，結(jié)果以平均值±標準差的形式表示，采用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行作圖、方差分析、顯著性分析以及聚類分析。均值間比較采用Duncan’s多重比較，顯著性檢驗在0.05水平上進行(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH和活菌數(shù)的變化

由圖1-a可知，3個超聲處理組的pH變化趨勢與對照組基本一致。在發(fā)酵的0～8 h，pH快速下降，且超聲處理組的pH下降速度快于對照組。之后各組別pH的變化幅度均趨于平穩(wěn)，超聲處理組與對照組之間pH差異不明顯。發(fā)酵過程中pH下降的主要因素是乳酸菌利用糖產(chǎn)生了大量的乳酸，在發(fā)酵初期，菌體代謝活力旺盛，超聲波可能會通過促進植物乳桿菌對糖的代謝利用來提高其產(chǎn)酸能力。但當pH下降到一定程度時，植物乳桿菌的產(chǎn)酸能力受到環(huán)境的限制，導致了超聲的作用效果不明顯。WU等[19]通過超聲波輔助混合菌種發(fā)酵酸奶證實了超聲對菌體產(chǎn)酸的促進作用，但該作用也僅體現(xiàn)在一定的pH范圍內(nèi)。

由圖1-b可知，接種至白果汁中的植物乳桿菌在0～8 h快速增殖，發(fā)酵12 h后菌種的生長速率變緩，之后進入穩(wěn)定期。在對數(shù)生長期內(nèi)，超聲處理組和對照組之間活菌數(shù)差異不顯著，這可能是因為對數(shù)期菌體生長旺盛，超聲處理的影響較小[20]。但進入穩(wěn)定期之后，超聲處理組的活菌數(shù)顯著高于對照組。尤其是在發(fā)酵后期，當對照組活菌數(shù)出現(xiàn)下降的趨勢時，超聲處理組的活菌數(shù)仍維持在一個較高的水平。這一現(xiàn)象可能與超聲波的空化效應有關。由于低頻低強度超聲波可產(chǎn)生穩(wěn)定且較溫和的空化效應，對菌體細胞造成可修復的損傷，增加了細胞膜的通透性，加速細胞內(nèi)外物質(zhì)的傳輸，提高了新陳代謝速率[3]。此外，超聲波可以將微生物在培養(yǎng)過程中形成的細胞束松散開來，提高了菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的利用，從而促進了菌體的生長繁殖，提高了微生物的生物量[2]?？傮w上，本實驗所選用的3個超聲強度對菌體的生長均有一定的促進作用，但3個強度之間的差異不顯著。

a-pH變化；b-活菌數(shù)變化圖1 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中pH和活菌數(shù)的變化Fig.1 Changes of pH value and viable cell counts during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.2 發(fā)酵過程中有機酸和單體糖含量的變化

低頻低強度超聲波處理對植物乳桿菌代謝有機酸和單體糖的影響如表1所示。未發(fā)酵白果汁中共鑒定出8種有機酸，分別為草酸、丙酮酸、奎尼酸、蘋果酸、莽草酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸，其中以檸檬酸的含量最高，乳酸在發(fā)酵后產(chǎn)生。單體糖有3種，分別為蔗糖、葡萄糖和果糖，以蔗糖的含量較高。在發(fā)酵過程中，3種單體糖含量均隨著發(fā)酵的進行大幅度降低。其中葡萄糖作為乳酸菌優(yōu)先利用的碳源，在植物乳桿菌接入后便被迅速消耗利用，而超聲處理組中植物乳桿菌對葡萄糖的利用能力顯著高于對照組，這可能與超聲提高了植物乳桿菌對葡萄糖的轉(zhuǎn)運能力，促進了相關水解酶的產(chǎn)生有關[19]。由于乳酸菌對葡萄糖的利用主要涉及糖酵解途徑，作為葡萄糖的轉(zhuǎn)化物，丙酮酸在發(fā)酵前4 h含量逐漸升高，且超聲處理組的丙酮酸的積累量高于對照組。丙酮酸可通過糖酵解途徑進一步轉(zhuǎn)化為乳酸。由表1可知，超聲處理組的乳酸產(chǎn)量在發(fā)酵的前12 h顯著高于對照組，特別是發(fā)酵第4 h，58.9、93.6和120.8 W/L超聲處理組的乳酸含量分別比對照組高21.8%、31.2%和36.2%。但之后幾個組別的差異不顯著，這與超聲處理對pH的影響情況基本一致。乳酸一方面可經(jīng)過糖酵解途徑產(chǎn)生，另一方面可直接由蘋果酸脫羧生成[21]。所以，蘋果酸含量在發(fā)酵開始后顯著降低，且超聲處理組，特別是93.6和120.8 W/L 2個超聲組在發(fā)酵前12 h的蘋果酸消耗速度顯著高于對照組。除此之外，檸檬酸、琥珀酸和富馬酸等與三羧酸循環(huán)密切相關的有機酸，在超聲處理組和對照組的含量差異也主要體現(xiàn)在發(fā)酵初期，尤其是發(fā)酵的前4 h。這可能是由于發(fā)酵后期乳酸大量積累使得整個代謝途徑受到抑制，從而削弱了超聲波的刺激作用。

為了更好地比較不同強度的低頻超聲處理下，植物乳桿菌代謝白果汁中有機酸和糖類的差異特征，以9種有機酸和3種單體糖的差異信息為基礎，采用組間平均鏈鎖法，按照指標間的平方Euclidean距離進行聚類分析，聚類分析結(jié)果如圖2所示。樣品基本按照了發(fā)酵時間點進行了聚類，說明不同發(fā)酵時間點植物乳桿菌對有機酸和糖的代謝差異較大，且超聲處理沒有使植物乳桿菌的糖酸代謝速率發(fā)生較大幅度的提升。但依據(jù)每個類別內(nèi)對照組和超聲處理組的位置排布可以發(fā)現(xiàn)，超聲處理組基本位于對照組的上方，即更接近于下一個發(fā)酵時間點植物乳桿菌的糖酸代謝狀態(tài)，說明本實驗選用的超聲條件可在一定程度上促進植物乳桿菌對有機酸和糖的代謝。

2.3 發(fā)酵過程中游離氨基酸含量的變化

低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中氨基酸的代謝情況如表2所示。白果汁中共鑒定出了17種氨基酸，大部分氨基酸經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵后含量有所下降，且超聲處理組和對照組在氨基酸代謝方面存在一定的差異。精氨酸作為白果汁中含量最高的氨基酸，在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在其含量快速上升的前12 h，超聲處理組的上升速度顯著高于對照組，這可能是因為超聲波促進了植物乳桿菌對蛋白質(zhì)的降解。之后由于乳酸菌可通過精氨酸脫亞氨基酶途徑對精氨酸進行轉(zhuǎn)化從而導致其含量降低[22]，但這個過程中超聲的作用效果不顯著。由于植物乳桿菌可產(chǎn)生谷氨酸脫羧酶將谷氨酸轉(zhuǎn)化為γ-氨基丁酸[23]，所以谷氨酸的含量在發(fā)酵24 h內(nèi)顯著降低。其中超聲處理組尤其是93.6、120.8 W/L 2個超聲處理組中谷氨酸的下降幅度分別是對照組的1.12、1.17倍。這說明超聲可刺激植物乳桿菌產(chǎn)生更多的谷氨酸脫羧酶來加快反應的進行。超聲的這一作用機制也體現(xiàn)在天冬氨酸以及蘇氨酸的代謝上。由于天冬氨酸可在乳酸菌產(chǎn)生的氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為草酰乙酸，并進一步轉(zhuǎn)化為二乙酰、乙偶姻和1，3-丁二醇等風味物質(zhì)[24]，而蘇氨酸則可在蘇氨酸醛縮酶的作用下轉(zhuǎn)化為乙醛，然后進一步轉(zhuǎn)化為乙酸和乙醇[25]，故兩者的含量均呈下降趨勢。3個超聲處理組中天冬氨酸和蘇氨酸的降幅均高于對照組，說明超聲可促進植物乳桿菌對天冬氨酸以及蘇氨酸的轉(zhuǎn)化。甘氨酸作為蘇氨酸轉(zhuǎn)化途徑的中間產(chǎn)物之一，其含量在發(fā)酵24 h后有所增加，且超聲處理組中甘氨酸的含量高于對照組，尤其是58.9 W/L超聲處理組中甘氨酸含量比對照組高11.36%，這也進一步證實了超聲對蘇氨酸轉(zhuǎn)化的促進作用。其他氨基酸，如亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸以及半胱氨酸，都可以在乳酸菌產(chǎn)生的特異性氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下轉(zhuǎn)化為相應的揮發(fā)性風味成分[24]，而超聲處理對這些氨基酸的代謝具有一定的促進作用，但在不同的發(fā)酵時間內(nèi)，作用效果存在一定的差異。

表1 低頻低強度超聲波處理對植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中有機酸及單體糖含量的影響 單位：g/L

圖2 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中有機酸和糖含量變化的聚類分析Fig.2 Clustering analysis of changes of organic acids and sugars content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low- intensity ultrasound

通過聚類分析可以更好地呈現(xiàn)不同強度的低頻超聲處理對植物乳桿菌代謝氨基酸的影響，聚類分析結(jié)果如圖3所示。所有的樣品并未嚴格按照發(fā)酵時間點進行聚類。在發(fā)酵第4 h，對照組與未發(fā)酵樣品聚為一類，而其他3個超聲組聚為一類，說明在發(fā)酵初期，低頻低強度超聲處理可顯著加快植物乳桿菌對白果汁中氨基酸的代謝。由于發(fā)酵12 h之后氨基酸含量整體的變化趨勢放緩，不同發(fā)酵時間點樣品之間的類間距離縮小，只在類間距離小于5時出現(xiàn)了聚類差異。在發(fā)酵第12 h和24 h，對照組和超聲組雖然聚為一類，但超聲組均比對照組更接近下一個發(fā)酵時間點的氨基酸代謝狀態(tài)，即超聲仍可在一定程度上促進植物乳桿菌對氨基酸的代謝。發(fā)酵第48 h，對照組和120.8 W/L的超聲組聚為一類，58.9 W/L的超聲組與發(fā)酵12 h的樣品聚為一類，而93.6 W/L的超聲組單獨聚為一類，說明在發(fā)酵后期，超聲整體的作用規(guī)律不明顯。

表2 低頻低強度超聲波處理對植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中氨基酸含量的影響 單位：mg/L

續(xù)表2

圖3 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中游離氨基酸含量變化的聚類分析Fig.3 Clustering analysis of changes of free amino acids content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.4 發(fā)酵過程中銀杏酸含量的變化

由圖4可知，白果汁中鑒定出了4種銀杏酸，分別為銀杏酸C15∶1、C17∶2、C15∶0、C17∶1，以銀杏酸C15∶1的含量最高。白果汁中的4種銀杏酸含量在乳酸菌發(fā)酵過程中均顯著降低，其中，超聲處理組與對照組中銀杏酸含量在發(fā)酵初期差異不顯著。隨著發(fā)酵的進行，尤其是12 h之后，超聲處理組中的銀杏酸含量開始低于對照組。發(fā)酵結(jié)束時，對照組中4種銀杏酸的總量由發(fā)酵前的(2.71±0.19) mg/L降低至發(fā)酵后(0.89±0.08)mg/L，降解率為67.13%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L的超聲處理組在發(fā)酵結(jié)束后，4種銀杏酸總量分別為(0.81±0.05)、(0.82±0.04)、(0.76±0.06)mg/L，降解率分別為70.09%、69.79%、72.12%左右。根據(jù)本實驗室之前的研究結(jié)果分析，銀杏酸的降解可能與菌體分泌的某種酶有關[9]。而低頻低強度超聲波在提高微生物產(chǎn)酶率，增強酶活性等方面早有報道[5]。NGUYEN等[26]采用20 kHz，強度為100 W的超聲輔助雙歧桿菌發(fā)酵牛奶，發(fā)現(xiàn)超聲波可以刺激雙歧桿菌胞內(nèi)乳糖酶的分泌。所以，超聲處理組中銀杏酸的降解率高于對照組，可能與低頻低強度超聲刺激了植物乳桿菌產(chǎn)生銀杏酸降解酶的機制有關。

a-銀杏酸C15∶1；b-銀杏酸C17∶2；c-銀杏酸C15∶0；d-銀杏酸C17∶1圖4 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中4種銀杏酸含量的變化Fig.4 Changes of four ginkgolic acids content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

2.5 發(fā)酵過程中銀杏萜內(nèi)酯含量的變化

由圖5可知，在未發(fā)酵的白果汁中共鑒定出3種銀杏萜內(nèi)酯，分別為銀杏內(nèi)酯A、銀杏內(nèi)酯B和銀杏內(nèi)酯C，以銀杏內(nèi)酯B的含量最高。白果汁中3種銀杏內(nèi)酯的含量均隨著發(fā)酵的進行逐漸升高，且對照組和超聲處理組的變化趨勢一致。在對銀杏內(nèi)酯A的富集方面，超聲處理組和對照組之間無顯著性差異。但在發(fā)酵后期，超聲處理組，尤其是93.6、120.8 W/L 2個超聲處理組顯示出了對銀杏內(nèi)酯B以及銀杏內(nèi)酯C的富集優(yōu)勢。到達發(fā)酵終點時，對照組中銀杏內(nèi)酯B的含量比發(fā)酵前提高了16.7%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L 3個超聲處理組分別將銀杏內(nèi)酯B含量提高了20.03%、23.93%、22.89%左右。對于銀杏內(nèi)酯C，對照組將其含量提高了15.03%左右，而58.9、93.6、120.8 W/L 3個超聲處理組則將其含量分別提高了18.27%、25.98%、22.61%。雖然乳酸菌對銀杏內(nèi)酯的合成機理尚不明晰，但根據(jù)本實驗室之前的結(jié)果分析，銀杏萜內(nèi)酯的合成與丙酮酸，乙酰輔酶A等物質(zhì)有關[27]，而這些物質(zhì)作為植物乳桿菌糖酸代謝的中間產(chǎn)物，其含量在超聲波的作用下有所增加，可能在一定程度上促進了銀杏萜內(nèi)酯的合成。

a-銀杏酸內(nèi)酯A；b-銀杏酸內(nèi)酯B；c-銀杏酸內(nèi)酯C圖5 低頻低強度超聲波輔助植物乳桿菌發(fā)酵白果汁過程中3種銀杏內(nèi)酯含量的變化Fig.5 Changes of three ginkgolides content during ginkgo kernel juice fermentation by L. plantarum assisted with low-frequency and low-intensity ultrasound

3 結(jié)論

研究選取的3個低強度的低頻超聲波均可促進植物乳桿菌在白果汁中生長，顯著提高了生長穩(wěn)定期活菌數(shù)，延緩其進入衰亡期的時間。在發(fā)酵初期，低頻低強度超聲處理可加快乳酸菌的代謝，促進植物乳桿菌對糖類的消耗，從而提高乳酸的產(chǎn)量。但當乳酸達到一定濃度時，超聲作用被削弱。同時，低頻低強度超聲處理可在發(fā)酵前12 h顯著加快植物乳桿菌對氨基酸的代謝進程。此外，低頻低強度超聲波有助于提升植物乳桿菌對銀杏酸的降解以及對銀杏內(nèi)酯的富集能力。發(fā)酵結(jié)束時，58.9、98.6、120.8 W/L的超聲處理組中，銀杏酸的總含量分別比對照組低9.01%、8.10%、15.18%，銀杏內(nèi)酯的總含量分別比對照組高0.10%、4.01%、2.67%。

通過研究結(jié)果可以看出，低頻低強度超聲波對植物乳桿菌代謝白果汁中的營養(yǎng)和生物活性成分具有一定的積極作用，為低頻低強度超聲波在提高微生物發(fā)酵效率方面的運用提供了試驗依據(jù)。此外，本研究所選取的3個強度的超聲波對發(fā)酵均未產(chǎn)生負面影響，這說明該強度均在菌體的可接受范圍內(nèi)。但3個超聲強度之間的作用效果差異不顯著，更適宜的超聲作用條件有待進一步的探索。