張鈺皎，陳忠軍，滿都拉，孫子羽，蘇杰，金晶晶，胡煒東，*

（1.內蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古農(nóng)業(yè)大學職業(yè)技術學院，內蒙古包頭014109）

乳桿菌是一類革蘭氏陽性、無芽孢桿菌，可以發(fā)酵糖類（主要指葡萄糖）產(chǎn)生大量乳酸[1]。其具有維持腸道菌群平衡、促進腸道吸收、預防腫瘤、降低膽固醇、增強免疫力和預防衰老的功效。乳桿菌生長過程中產(chǎn)生的有機酸、過氧化氫等次級代謝產(chǎn)物對食品中的腐敗菌具有一定抑制作用，因此其代謝產(chǎn)物常被用作食品加工和保藏過程中的天然防腐劑[2-4]。

細菌生物被膜（biofilm）是細菌適應脅迫環(huán)境的一種生存方式。食源性病原菌可以黏附于食品接觸表面進行生長繁殖而形成生物被膜[5]。食源性病原菌生物被膜不僅會對食品加工設備、加工廠地板和墻壁表面等造成污染，還會導致食品的交叉污染、保質期降低等問題。病原菌形成生物被膜后對抗生素和抑菌劑的抵抗作用加強，較難以被清除[6]。金黃色葡萄球菌（Stap-hylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性病原菌。在食品加工過程中，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌不僅能單獨形成生物被膜，還能聯(lián)合形成混合菌生物被膜[7]。

群體感應系統(tǒng)（quorum sensing，QS）是微生物通過分泌整合特定的信號分子，以啟動細胞運動和生物被膜形成等行為的一種通訊機制[8]。AI-2信號分子廣泛存在于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌中，其不僅可介導種間交流，還可介導不同菌屬間的相互交流[9-10]。因此，AI-2信號分子介導的群體感應系統(tǒng)在食源性病原菌生物被膜的建立和發(fā)展中起著至關重要的作用。

本研究選用從內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選的5株乳桿菌，通過雙層平板法、結晶紫染色法及AI-2分子活性測定，確定其所產(chǎn)抑菌活性物質對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌的單一菌生物被膜和混合菌生物被膜形成的干預作用。旨在尋求一種在食品加工和保藏過程中能有效控制病原菌生物被膜的天然抑菌劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

乳桿菌（菌株編號 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5）：分離自內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品；大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、沙門氏菌（Salmonella）ATCC 14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、哈維弧菌（V.harveyi BB170）：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

NaCl、MgSO4、KOH、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、精氨酸、甘油：分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250溶液：廣東環(huán)凱微生物科技公司。

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（tryptonesoybroth，TSB）、MRS培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋生物技術有限公司；AB 培養(yǎng)基：0.3 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgSO4，0.2%酸水解酪蛋白，用KOH調節(jié)pH值至7.5，121℃高壓滅菌20 min，冷卻后每100 mL培養(yǎng)基中加入1 mL 1mol/L PBS，1mL 0.1mol/L精氨酸和2 mL 50%甘油。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2DF（標準型）雙人單面凈化工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；Synergy H1全功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司；LDZX全自動高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；SHB-III循環(huán)水真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；JY系列電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；GHP隔水式恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學儀器有限公司；UV752紫外可見光分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；NU-C200R-E離心機：北京布拉德科技發(fā)展有限公司；XH-C漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物的制備

乳桿菌ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5活化3代后，將菌懸液以4%的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中進行擴大培養(yǎng)，37℃厭氧培養(yǎng)24 h；4 000 r/min離心10 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾后于旋轉蒸發(fā)儀中（45℃～55℃）濃縮至25倍；加入飽和硫酸銨溶液使?jié)饪s物飽和度達60%，4℃放置過夜。離心（12 000 r/min，20 min，4℃）取沉淀，無菌PBS溶液溶解后得乳桿菌蛋白粗提液[11-12]。

1.3.2 指示菌菌懸液的制備

大腸桿菌ATCC 11775-3、金黃色葡萄球菌CMCC 26003-3、沙門氏菌ATCC 14028于37℃下活化后，無菌PBS梯度稀釋至OD600nm=0.1，備用。

1.3.3 Bradford法測定蛋白質含量

以0.1 mg/mL牛血清蛋白為標準溶液，繪制標準曲線。按表1所示加入相應試劑，漩渦振蕩混勻后室溫（約25℃）靜置2 min，以0號管作為空白對照，于595 nm波長下測定吸光值，以牛血清蛋白含量為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線[13]。

表1 標準曲線所有試劑Table 1 Reagents used in standard curve

0.1 mL待測樣品，加入5 mL考馬斯亮藍G-250，混勻并室溫（約為25℃）靜置2 min后于波長595 nm下測定吸光值。根據(jù)標準曲線，計算樣品蛋白質含量。

1.3.4 乳桿菌代謝產(chǎn)物對3株病原菌浮游菌活性的測定

雙層平板法測定抑菌性：水瓊脂培養(yǎng)基倒板，待板凝固后用鑷子將無菌牛津杯置于水瓊脂上；無菌生理鹽水將3株指示菌梯度稀釋至103CFU/mL；1 mL指示菌液加入到25 mL TSB瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后倒入平皿中，凝固后取出牛津杯；于牛津杯里加入200 μL乳桿菌蛋白粗提液，37℃培養(yǎng)24 h后量取抑菌圈直徑[14]。

1.3.5 乳桿菌代謝產(chǎn)物對單一菌和混合菌生物被膜形成的影響

1.3.5.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物對單一菌生物被膜形成的影響

200 μL TSB 培養(yǎng)基（含 5 株終濃度為 40、50、60、70、80 μg/mL的乳桿菌蛋白粗提液）加入96孔微量板中，將OD600nm=0.1的3株病原菌菌懸液分別按照體積比1∶100接種于96孔板中，37℃下培養(yǎng)24 h后棄去菌液。每孔加入300 μL磷酸鹽緩沖液沖洗3次去除浮游菌；用200 μL無水甲醇固定15 min后棄液，60℃下干燥1 h；加入200 μL 2%結晶紫染液染色20 min，蒸餾水洗去多余染液；干燥后加入300 μL 33%冰醋酸反應10 min，酶標儀測定630 nm下的吸光值[15]。平行試驗3次，抑制率計算公式為：

1.3.5.2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對混合菌生物被膜形成的影響

OD600nm=0.1的3株病原菌菌懸液按體積比1∶1∶1混合后以1%的接種量接種于96孔板中，乳桿菌蛋白代謝物加量及生物被膜培養(yǎng)測定方法同1.3.5.1。

1.3.6 乳桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌群體感應信號分子的影響

1.3.6.1 乳桿菌代謝產(chǎn)物對單一菌AI-2分子釋放的影響

將10 μL OD600nm=0.1的3株病原菌分別接種于1 mL TSB培養(yǎng)基（含終濃度為60 μg/mL乳桿菌代謝產(chǎn)物），37℃培養(yǎng)8 h后離心（12 000 r/min，10 min）取上清液，0.22 μm濾膜過濾后保存于4℃冰箱。AI-2分子的報告菌株V.harveyi BB170于30℃搖床轉速200 r/min培養(yǎng)過夜，用新鮮AB培養(yǎng)基以1∶5 000（體積比）稀釋V.harveyi BB170培養(yǎng)物。96孔板的每孔中加入10 μL含乳桿菌的過濾液和100 μL稀釋后的AB培養(yǎng)液，同時以不加乳桿菌的稀釋液上清液做對照。于30℃、200 r/min下培養(yǎng)，酶標儀每隔1 h測一次發(fā)光值，直至5 h，平行試驗3次。試驗結果以相對活性強度表示，即試驗組上清液的發(fā)光強度與陽性對照組的發(fā)光強度之比，當陽性對照組的發(fā)光強度達到最大時，設此時的相對活性強度為100%[16]。

1.3.6.2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對混合菌AI-2分子釋放的影響

將OD600nm=0.1的3株病原菌以體積比1∶1∶1混合后，取10 μL接種于1 mL TSB培養(yǎng)基（含終濃度為60 μg/mL乳桿菌代謝產(chǎn)物），37℃培養(yǎng)8 h后離心（12 000 r/min，10 min） 取上清液，0.22 μm 濾膜過濾后保存于4℃冰箱?；旌暇鶤I-2信號分子相對活性強度的測定同1.3.6.1。

2 結果與分析

2.1 蛋白質標準曲線

以0.1 mg/mL牛血清蛋白溶液為標準溶液，以牛血清蛋白含量為橫坐標，A595為縱坐標繪制蛋白質標準曲線，結果如圖1所示。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Protein standard curve

該曲線線性回歸方程為：Y=0.005x+0.037 3，R2=0.995 3，表明標準牛血清蛋白溶液濃度在0～100 μg/mL的線性關系良好。

2.2 牛津杯法測定抑菌活性

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為指示菌，測定5株乳桿菌的抑菌活性，結果見表2。

表2 5株乳桿菌的抑菌效果Table 2 Antibacterial activity of five Lactobacillus mm

如表2所示，5株乳桿菌蛋白粗提液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌均有抑制作用。其對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最強，沙門氏菌和大腸桿菌次之，且抑菌強度均為ALAC-5＞ALAC-1＞ALAC-2＞ALAC-4＞ALAC-3。

2.3 乳桿菌代謝產(chǎn)物對單一菌和混合菌生物被膜形成的影響

于事先裝有 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4、ALAC-5代謝產(chǎn)物的TSB培養(yǎng)基中分別接種食源性細菌（金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和大腸桿菌）及其混合菌，37℃下培養(yǎng)24 h后通過結晶紫染色法測定其生物被膜的形成能力，結果見圖2。

圖2 乳桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌生物被膜形成能力的影響Fig.2 Effect of Lactobacillus metabolites on biofilm formation ability of pathogenic bacteria

由圖 2 可知，ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4和ALAC-5代謝產(chǎn)物均可抑制3株病原菌及其混合菌生物被膜的形成，且生物被膜的形成力隨著粗提液蛋白含量的增大而逐漸減弱。ALAC-5代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及其混合菌的成膜能力抑制率最高，ALAC-4最弱。在未添加乳桿菌代謝產(chǎn)物時，金黃色葡萄球菌生物被膜在630 nm下的吸光度為 0.095±0.005 3，大腸桿菌 0.16±0.004，沙門氏菌0.093±0.002 6，混合菌 0.073±0.001，混合菌生物被膜的OD值明顯低于3株病原菌單獨形成的生物被膜，這是因為在混合菌生物被膜中，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌間存在競爭作用，使得膜中各菌株數(shù)量明顯減少。Rüger M等[17]通過對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的混合菌生物被膜研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株間的拮抗性使得其生長速度及數(shù)量明顯減弱。Millezi F等[18]研究發(fā)現(xiàn)在雙菌種生物膜中，大腸桿菌會降低金黃色葡萄球菌的易感性。

當乳桿菌代謝產(chǎn)物中的蛋白含量為80 μg/mL時，ALAC-1、ALAC-5對大腸桿菌生物被膜的抑制率最強，分別為 63.67%、66.39%，菌株 ALAC-2、ALAC-3次之，抑制率分別為61.80%、51.98%，ALAC-4最弱，為49.27%；對沙門氏菌生物被膜抑制率大小為：ALAC-5（74.91%）＞ALAC-1（65.23%）＞ALAC-2（56.99%）＞ALAC-4（45.16%）＞ALAC-3（40.50%），相比大腸桿菌，沙門氏菌對ALAC-5和ALAC-1敏感性較強，對其余4株較弱之；ALAC-5對金黃色葡萄球菌生物被膜的抑制率高達78.95%，其余4株抑制作用同大腸桿菌，即 ALAC-1（69.47%）＞ALAC-2（51.23%）＞ALAC-3（45.61%）＞ALAC-4（36.49%），但 ALAC-2、A LAC-3和ALAC-4對金黃色葡萄球菌的抑制作用低于大腸桿菌和沙門氏菌；混合菌生物被膜抑制率為ALAC-5（51.82%）＞ALAC-1（44.55%）＞ALAC-2（39.10%）＞ALAC-3（32.72%）＞ALAC-4（31.36%），混合菌生物被膜對乳桿菌代謝產(chǎn)物的抗性高于3株單一菌生物被膜，因為混合菌生物被膜中各個菌株分泌胞外多糖等物質的多樣性，使得菌株間的黏連作用及相互作用力更強，較難以被外界不利因素所影響，增加了混合菌生物被膜的耐藥性[19-20]。

2.4 乳桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌AI-2活性的影響

通過報告菌株V.harveyi BB170的生物發(fā)光值，測定了5株乳桿菌代謝產(chǎn)物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌及其混合菌AI-2信號分子活性的影響，結果如圖3所示。

圖3 乳桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌AI-2活性的影響Fig.3 Effect of Lactobacillus metabolites on activity of pathogenic AI-2

V.harveyi BB170可調控群體感應信號分子AI-2，菌株上清液中的AI-2分子的含量越高，發(fā)光強度越大[21]。由圖3可知，5株乳桿菌代謝產(chǎn)物對3株病原菌及其混合菌的AI-2相對活性均有影響，相比空白對照，添加了乳桿菌代謝產(chǎn)物的上清液AI-2分子活性明顯降低。添加了ALAC-1、ALAC-5代謝產(chǎn)物的大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及其混合菌的AI-2信號分子活性最低，說明這2株乳桿菌對病原菌的抑制作用最強，再次佐證了分離自內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳桿菌對病原菌的抑制作用。

3 結論

本研究以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌為指示菌，研究了內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選的乳桿菌 ALAC-1、ALAC-2、ALAC-3、ALAC-4 和 ALAC-5代謝產(chǎn)物對病原菌及其生物被膜的抑制作用，并通過群體感應信號分子AI-2相對活性的檢測進一步證實了乳桿菌代謝產(chǎn)物對病原菌的抑制作用。結果表明，5株乳桿菌對單一菌和混合菌生物被膜均有抑制作用，且隨著代謝產(chǎn)物中蛋白濃度的增加，生物被膜的形成能力逐漸減弱；ALAC-1和ALAC-5代謝產(chǎn)物對病原菌生物被膜及其AI-2活性抑制效果最好。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌是食品工業(yè)中最常見的食源性病原菌，同時也是引起食品污染及腐敗的主要污染菌，大量研究表明，這些細菌可形成生物被膜以增加對不良環(huán)境條件的抗性，給食品加工生產(chǎn)與人們的生活帶來不便。因此本試驗從內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中篩選了具有抑菌作用的乳桿菌，研究其對病原菌及其生物被膜的抑制作用，不僅為食品實際生產(chǎn)提供了一種天然防腐劑，也為之后篩選乳桿菌抑菌基因提供了理論基礎。