張南南 吳小紅 王銘洲 曹 輝 夏 捷 金建忠

（浙江樹(shù)人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院 杭州310015）

黃酒是我國(guó)的古老酒種，源于中國(guó)，與啤酒、葡萄油并稱為世界三大古酒。黃酒香氣濃郁，味美甘甜，風(fēng)味醇厚，并含有氨基酸、糖、有機(jī)酸和多種維生素等營(yíng)養(yǎng)成分。不同陳釀年份的黃酒品質(zhì)和價(jià)格差距較大。然而，黃酒生產(chǎn)和陳釀過(guò)程中無(wú)統(tǒng)一的評(píng)價(jià)和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，少數(shù)企業(yè)有隨意標(biāo)注酒齡的行為[1]，如市售黃酒中存在以低酒齡黃酒冒充高酒齡黃酒的所謂“八年陳黃酒”、“十年陳黃酒”。鑒于此，建立一套快速、簡(jiǎn)便、有效的評(píng)價(jià)系統(tǒng)，對(duì)黃酒品種和陳釀年份的鑒別有極其重要的作用。

指紋圖譜是經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析儀器測(cè)定得到的組分群體的特征圖譜或圖像。指紋圖譜能較充分地反映酒中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)[2]。酒類指紋圖譜研究較多的是葡萄酒[3-6]和白酒[7-10]，對(duì)黃酒研究得較少[1，11]，大多采用氣相色譜法、高效液相色譜法及高級(jí)儀器聯(lián)用技術(shù)?，F(xiàn)有方法均需對(duì)酒類樣品進(jìn)行預(yù)處理，設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜。電化學(xué)指紋圖譜具有樣品無(wú)需預(yù)處理，靈敏，操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)，近年來(lái)廣泛應(yīng)用于中草藥的鑒別[12-14]。

本試驗(yàn)中采用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3振蕩體系，系統(tǒng)考察振蕩體系各因素對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響，在最佳測(cè)定條件下建立會(huì)稽山不同品種和陳釀年份黃酒的指紋圖譜，用于黃酒陳釀年份和品種的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

純和十二年紹興花雕酒、純和八年紹興花雕酒、古釀六年紹興花雕酒、古釀三年紹興花雕酒、純正五年紹興酒、醇香三年黃酒、宋法原造三年陳紹興花雕酒，產(chǎn)自會(huì)稽山紹興酒股份有限公司。

硫酸、溴酸鉀、丙二酸、硫酸鈰銨均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

CHI620E 型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司；RTC 基本型磁力攪拌器+ETS D5，德國(guó)IKA；217 型飽和甘汞電極、213 型鉑電極，天津艾達(dá)恒晟科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 電化學(xué)指紋圖譜測(cè)定 量取一定量的黃酒加入反應(yīng)器中，在保持反應(yīng)總體積100 mL 的前提下依次加入一定量的硫酸、硫酸鈰銨和丙二酸溶液，在設(shè)定溫度和攪拌速度下恒溫?cái)嚢?0 min后加入一定量溴酸鉀，繼續(xù)恒溫?cái)嚢?。?17 飽和甘汞電極作參比，213 型鉑電極作指示電極，以溴酸鉀加入時(shí)計(jì)時(shí)，記錄電化學(xué)振蕩體系中電位（E）隨時(shí)間（t）的變化，獲取黃酒電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)，繪制E-t 曲線。

1.3.2 系統(tǒng)相似度計(jì)算方法 參照方宣啟等[15]報(bào)道的系統(tǒng)相似度計(jì)算方法，以各種黃酒電化學(xué)指紋圖譜平均參數(shù)為參照，計(jì)算黃酒指紋圖譜系統(tǒng)相似度，計(jì)算公式如下：

式中：Q積——系統(tǒng)相似度；n——參數(shù)的個(gè)數(shù)；ai，bi——每個(gè)圖譜第i 個(gè)參數(shù)的平均值或?qū)?yīng)的第i 個(gè)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃酒電化學(xué)指紋圖譜測(cè)定條件

選取會(huì)稽山醇香三年黃酒與純正五年紹興酒做對(duì)比試驗(yàn)，以誘導(dǎo)時(shí)間、最大振幅、振蕩壽命、最高電位和最低電位5 個(gè)電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)的差值最大化為目標(biāo)，做單因素試驗(yàn)，研究溫度、轉(zhuǎn)速、硫酸鈰銨濃度、氫離子濃度、丙二酸濃度、溴酸鉀及黃酒用量等因素對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響，確定最佳的電化學(xué)指紋圖譜測(cè)定條件。

2.1.1 溫度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響 在其它條件（6.00 mL 黃酒，轉(zhuǎn)速850 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別在34，35，36，37，38，39，40℃測(cè)定所選2 種黃酒的電化學(xué)指紋圖譜，研究溫度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1和表1。試驗(yàn)表明：溫度太低振蕩不明顯，34℃時(shí)會(huì)稽山純正五年紹興酒幾乎無(wú)振蕩產(chǎn)生，故舍去；39℃時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間差、最低電位差、振蕩壽命差以及最大振幅差均為最大值，因此選取39℃為最適溫度。

圖1 不同溫度下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.1 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different temperatures

表1 不同溫度下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 1 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different temperatures

2.1.2 黃酒加入量對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響在其它條件（溫度39℃，轉(zhuǎn)速850 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116g） 不變的情況下，分別加入8.00，4.00，2.00，1.60，1.40，1.20 mL黃酒做試驗(yàn)，黃酒加入量對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響見(jiàn)圖2和表2。加入黃酒8.00 mL 時(shí)幾乎看不到振蕩曲線，隨著黃酒量的減少，振蕩壽命和振蕩幅度增加，當(dāng)黃酒加入量為1.40 mL 時(shí)圖譜差距最大。最終選擇1.40 mL 為黃酒最佳加入量。

2.1.3 轉(zhuǎn)速對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響 在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別在850，800，750，700，650，600 r/min 轉(zhuǎn)速下做試驗(yàn)，考察攪拌速度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3和表3。當(dāng)轉(zhuǎn)速為650 r/min 時(shí)兩種黃酒的圖譜參數(shù)相差最大。最終選擇650 r/min為最佳轉(zhuǎn)速。

圖2 不同黃酒加入量的電化學(xué)指紋圖譜Fig.2 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different dosages

表2 不同黃酒加入量的會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 2 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different Chinese rice wine dosages

圖3 不同轉(zhuǎn)速下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.3 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different stirring rates

表3 不同轉(zhuǎn)速下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 3 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different stirring rates

2.1.4 溴酸鉀濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響在其它條件（1.40 mL 黃酒，溫度39℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L） 不變的情況下，分別加入溴酸鉀0.8484 g （0.05080 mol/L）、0.9280 g（0.05880 mol/L）、1.116 g （0.06680 mol/L）、1.249 g（0.07480 mol/L）做試驗(yàn)，考察溴酸鉀濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響（圖4和表4）。隨著溴酸鉀濃度增大，振蕩曲線的振蕩壽命延長(zhǎng)，當(dāng)溴酸鉀用量1.116 g，溶液中濃度為0.06680 mol/L 時(shí)，兩張圖譜的參數(shù)差值最大，最終選擇溴酸鉀1.116 g 為最佳條件。

圖4 同溴酸鉀濃度下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.4 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different KBrO3 concentrations

表4 不同溴酸鉀濃度下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 4 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different KBrO3 concentrationas

2.1.5 硫酸鈰銨濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響 在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，氫離子濃度2.000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別加入0.1000 mol/L 硫酸鈰銨溶液4.00，5.00，6.00，7.00，8.00 mL，其濃度分別為0.004000，0.005000，0.006000，0.007000，0.008000 mol/L，考察硫酸鈰銨濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響（圖5和表5）。當(dāng)溶液中硫酸鈰銨濃度為0.006000 mol/L 時(shí)，圖譜參數(shù)相差最大，為試驗(yàn)最佳條件。

圖5 不同硫酸鈰銨濃度下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.5 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

表5 不同硫酸鈰銨濃度下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 5 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different （NH4）4Ce（SO4）4 concentrations

2.1.6 氫離子濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，丙二酸0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g），分別在氫離子濃度 為2.000，1.800，1.600，1.400、1.200 mol/L 的條件下試驗(yàn)，考察氫離子濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響（圖6和表6）。當(dāng)溶液中氫離子濃度為1.800 mol/L 時(shí)圖譜參數(shù)相差最大，為試驗(yàn)最佳條件。

圖6 不同氫離子濃度下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.6 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

表6 不同氫離子濃度下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 6 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different hydrogen ion concentrations

2.1.7 丙二酸濃度對(duì)黃酒電化學(xué)指紋圖譜的影響在其它條件 （1.40 mL 黃酒，溫度39 ℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨0.006000 mol/L，氫離子濃度1.800 mol/L，溴酸鉀1.116 g） 不變的情況下，分別加 入1.000 mol/L 丙 二 酸10.00，8.00，6.00，4.00 mL（濃度分別為0.1000，0.08000，0.06000，0.04000 mol/L）做試驗(yàn)，其黃酒電化學(xué)指紋圖譜見(jiàn)圖7和表7。當(dāng)丙二酸加入量為4.00 mL 時(shí)因丙二酸不足而導(dǎo)致振蕩效果不佳；當(dāng)丙二酸加入量為6.00 mL 時(shí)振蕩時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，醇香三年甚至超過(guò)1 h；當(dāng)丙二酸加入量為8.00 mL 比加入量10.00 mL 時(shí)參數(shù)相差大，最終選擇8.00 mL（0.08000 mol/L）為最佳條件。

圖7 不同丙二酸濃度下黃酒的電化學(xué)指紋圖譜Fig.7 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

表7 不同丙二酸濃度下會(huì)稽山醇香三年黃酒和純正五年紹興酒的電化學(xué)指紋圖譜特征參數(shù)差值Table 7 The difference of charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan 3 years Chinese rice wine and Kuaijishan 5 years Chinese rice wine at different CH2（COOH）2 concentrations

2.2 黃酒電化學(xué)指紋譜庫(kù)建立及相似度判斷

在上述試驗(yàn)確定的最佳黃酒電化學(xué)指紋圖譜測(cè)定條件下，對(duì)7 種會(huì)稽山公司生產(chǎn)的不同品種和陳釀年份黃酒進(jìn)行測(cè)定。分別平行測(cè)定3 份，建立其電化學(xué)指紋譜庫(kù)（圖8和表8），并以各種黃酒電化學(xué)指紋圖譜平均參數(shù)為參照，計(jì)算黃酒電化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)相似度（結(jié)果見(jiàn)表9）。

結(jié)果顯示：同種黃酒電化學(xué)指紋圖譜的系統(tǒng)相似度在98.03%～99.57%范圍，不同種黃酒的系統(tǒng)相似度在83.36%～97.14%范圍。以臨界系統(tǒng)相似度Qc=（97.14%+98.03%）/2=97.59%作為鑒別品種的判據(jù)，即電化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)相似度＞97.59%時(shí)屬同種黃酒，當(dāng)相似度≤97.59%時(shí)為非同種黃酒。

表8 會(huì)稽山黃酒電化學(xué)指紋圖譜參數(shù)Table 8 The charateristic parameters of electrochemical fingerprints of Kuaijishan Chinese rice wine

（續(xù)表8）

表9 以各種黃酒電化學(xué)指紋圖譜參數(shù)為參照計(jì)算的黃酒指紋圖譜系統(tǒng)相似度Table 9 The system similarities of electrochemical fingerprints of Chinese rice wine based on electrochemical fingerprint parameters of all kinds of Chinese rice wine

圖8 黃酒電化學(xué)指紋圖譜Fig.8 Electrochemical fingerprints of Chinese rice wine

3 結(jié)論

選 用H2SO4-（NH4）4Ce（SO4）4-CH2（COOH）2-KBrO3為振蕩體系，確定黃酒電化學(xué)指紋圖譜最佳的測(cè)定條件為：溶液總體積100 mL，溫度39℃，轉(zhuǎn)速650 r/min，硫酸鈰銨濃度0.006000 mol/L，氫離子濃度1.800 mol/L，丙二酸濃度0.08000 mol/L，溴酸鉀1.116 g，黃酒1.40 mL。不同品種和陳釀年份黃酒的電化學(xué)指紋圖譜主要特征參數(shù)存在著顯著差異，并有很好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。采用電化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)相似度可識(shí)別黃酒的品種和陳釀年份，當(dāng)電化學(xué)指紋圖譜系統(tǒng)相似度＞97.59%時(shí)屬同種黃酒，當(dāng)相似度≤97.59%時(shí)為非同種黃酒。本研究為不同黃酒品種和陳釀年份的鑒別提供了一種簡(jiǎn)便方法。