陳 洋，陰魯鑫，李琳琳，王天男，劉宇昊，高文昌

膠質(zhì)瘤是源自神經(jīng)上皮最常見的腦惡性腫瘤，占原發(fā)性成人腦腫瘤的70%。膠質(zhì)瘤易復(fù)發(fā)且具有浸潤(rùn)性，預(yù)后不良[1]。高級(jí)別膠質(zhì)瘤最具侵襲性，近50%的患者在1～2年內(nèi)死亡。由于膠質(zhì)瘤多呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，手術(shù)徹底切除難度大，復(fù)發(fā)率高，且化療副作用大，因此基因治療和靶向藥物治療成為當(dāng)今全球研究膠質(zhì)瘤的熱點(diǎn)。研究表明，拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomerase Ⅱ, TOPⅡ)的表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)，可能影響患者的預(yù)后[2-3]。異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1, IDH1)作為膠質(zhì)瘤預(yù)后的主要分子標(biāo)記，可能提示較好的預(yù)后[4]。本文回顧性分析89例膠質(zhì)瘤標(biāo)本，探究TOPⅡ、IDH1與膠質(zhì)瘤惡性程度及其預(yù)后的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料收集2014年1月～2017年10月徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科行手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查確診的膠質(zhì)瘤標(biāo)本89例，其中男性48例，女性41例，年齡23～74歲，平均50.6歲。包含高級(jí)別膠質(zhì)瘤56例，其中間變性星形細(xì)胞瘤(Ⅲ級(jí))18例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(IV級(jí))38例；低級(jí)別膠質(zhì)瘤33例，其中少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤(Ⅱ級(jí))8例，星形細(xì)胞瘤(Ⅱ級(jí))25例。

1.2 隨訪對(duì)患者本人或家屬進(jìn)行電話隨訪，隨訪時(shí)間自患者手術(shù)日開始，截至2019年12月，每隔數(shù)月定期隨訪，隨訪內(nèi)容包括患者術(shù)后是否放化療、是否死亡及死亡具體時(shí)間，直至隨訪結(jié)束，期間失訪8例，失訪人員不納入統(tǒng)計(jì)范圍。

1.3 試劑即用型鼠抗人TOPⅡ單克隆抗體和IDH1 R132H鼠抗人單克隆抗體均購(gòu)自北京中杉金橋公司，DAB顯色劑、EDTA(pH 8.4)修復(fù)液、PBS緩沖液、二抗均購(gòu)自羅氏(上海)公司。

1.4 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，分別行HE及免疫組化EnVision法染色，染色步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，返藍(lán)；乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5 判斷標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師閱片后，取得一致意見，以腫瘤周圍正常腦組織作為內(nèi)對(duì)照。免疫組化染色結(jié)果以細(xì)胞膜、質(zhì)、核中分別存在粗細(xì)一致的棕黃色顆粒為陽(yáng)性。IDH1為胞質(zhì)陽(yáng)性，光鏡下隨機(jī)觀察數(shù)個(gè)高倍視野，記錄高倍視野中陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，采用染色判定標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤細(xì)胞數(shù)≥5%即IDH1陽(yáng)性(IDH1突變型)。細(xì)胞核陽(yáng)性為TOPⅡ陽(yáng)性，每張切片計(jì)數(shù)所有TOPⅡ陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)，為TOPⅡ的百分比，陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，TOPⅡ、IDH1表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)分析，TOPⅡ、IDH1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析法，臨床因素與生存時(shí)間的關(guān)系用Kaplan-Meier生存曲線表示，再用Log-rank法分析，多因素采用Cox回歸分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TOPⅡ、IDH1表達(dá)與膠質(zhì)瘤惡性程度的關(guān)系TOPⅡ、IDH1表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別有關(guān)。TOPⅡ在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率為26.7%，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率為90.2%(圖1A)；IDH1在低級(jí)別膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率為63.3%(圖1B)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤中的陽(yáng)性率為9.8%(表1)。

表1 不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中TOPⅡ和IDH1的表達(dá)

圖1 A.膠質(zhì)瘤組織中TOPⅡ陽(yáng)性，EnVision法；B.膠質(zhì)瘤組織中IDH1陽(yáng)性，EnVision法

采用等級(jí)相關(guān)分析TOPⅡ與IDH1表達(dá)之間的關(guān)系(表2)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，TOPⅡ與IDH1在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.459，P<0.001)。

表2 膠質(zhì)瘤組織中TOPⅡ與IDH1表達(dá)的相關(guān)性

2.2 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素各因素與生存時(shí)間的關(guān)系采用生存曲線表示(圖2)，用Log-rank檢驗(yàn)計(jì)算中位生存期和1年生存率，根據(jù)臨床病理因素分組(表3)，結(jié)果顯示，患者年齡、病理級(jí)別、術(shù)前KPS評(píng)分、術(shù)后放化療、TOPⅡ表達(dá)和IDH1表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)，與患者性別無關(guān)。IDH1陽(yáng)性患者生存期較長(zhǎng)，TOPⅡ陽(yáng)性患者預(yù)后較差，病理級(jí)別低、術(shù)前KPS評(píng)分高、術(shù)后放化療的年輕患者預(yù)后相對(duì)較好。

2.3 膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的單因素分析變量篩選方法：逐一對(duì)自變量進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，計(jì)算P值，將P<0.05的變量納入多因素Cox回歸分析(表3，圖2)，患者年齡、術(shù)前KPS評(píng)分、病理級(jí)別、術(shù)后放化療、TOPⅡ和IDH1表達(dá)滿足變量篩選。

圖2 Kaplan-Meier生存曲線:A.病理級(jí)別與預(yù)后的關(guān)系；B.術(shù)后放化療與預(yù)后的關(guān)系；C.TOPⅡ表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系；D.IDH1表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

表3 各臨床病理特征與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系

2.4 影響膠質(zhì)瘤患者術(shù)后預(yù)后的多因素回歸分析將單因素分析中有意義的臨床要素選入多因素分析，以P=0.05水平進(jìn)行篩查，IDH1陽(yáng)性、病理級(jí)別和術(shù)后放化療嚴(yán)重影響膠質(zhì)瘤的預(yù)后，病理級(jí)別分型是膠質(zhì)瘤預(yù)后的危險(xiǎn)因素，IDH1陽(yáng)性、術(shù)后放化療是膠質(zhì)瘤預(yù)后的保護(hù)因素(表4)。病理級(jí)別高的膠質(zhì)瘤患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是病理級(jí)別低患者的5.231倍，而術(shù)后放化療患者的死亡危險(xiǎn)是術(shù)后無放化療患者的0.205倍，IDH1陽(yáng)性患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是IDH1陰性患者的0.388倍。

表4 臨床影響因素與患者預(yù)后的Cox回歸分析

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素共同參與的復(fù)雜過程，其中包含多個(gè)細(xì)胞因子及癌癥基因的共同作用。由于這些細(xì)胞因子和癌癥基因的異常表達(dá)而使腫瘤增殖潛能和疾病預(yù)后相應(yīng)發(fā)生變化。因此，探究影響膠質(zhì)瘤的臨床病理因素對(duì)早期判斷疾病預(yù)后和精準(zhǔn)治療有重要的指導(dǎo)意義。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)膠質(zhì)瘤患者術(shù)后的臨床病理資料進(jìn)行回顧性分析，以探討TOPⅡ、IDH1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)特點(diǎn)及與預(yù)后的關(guān)系。

DNA TOP是經(jīng)過催化DNA鏈的斷裂和聯(lián)合從而控制DNA拓?fù)錉顟B(tài)的一類酶。其位于細(xì)胞核內(nèi)，主要分為TOPI和TOPⅡ，其中TOPⅡ?qū)儆谕投垠w蛋白質(zhì)。其是DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和染色體分離所必需的，與細(xì)胞增殖有關(guān)，也是抗癌藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn)[5]。其中TOPⅡa通過各種方式在腫瘤的發(fā)展中起重要作用。有研究表明，TOPⅡa產(chǎn)物存在于腫瘤組織中，這些產(chǎn)物可以刺激和促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和免疫抑制，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡并導(dǎo)致對(duì)化療的抵抗[6]。這與本組實(shí)驗(yàn)得出TOPⅡ陽(yáng)性患者預(yù)后較差的結(jié)論一致。TOPⅡa與活躍的細(xì)胞增殖有關(guān)，同時(shí)也是多種化療藥物的分子靶點(diǎn)，其表達(dá)水平是影響化療敏感性的重要因素[7]。臨床上應(yīng)用TOPⅡ靶向藥物正是通過干擾DNA和TOPⅡ的結(jié)合或增加DNA-TOP共價(jià)復(fù)合物的濃度來實(shí)現(xiàn)的。在常見的細(xì)胞毒性藥物中，蒽環(huán)類藥物如阿霉素和依托泊苷是通過結(jié)合DNA-TOPⅡa復(fù)合物并抑制DNA的再連接起作用的。其能有效干擾TOPⅡ重新連接斷裂的DNA雙鏈，破壞其3級(jí)結(jié)構(gòu)，從而阻礙DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和RNA合成過程，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[8]?；艉２╗9]的研究亦發(fā)現(xiàn)TOPⅡa高表達(dá)，提示體內(nèi)腫瘤組織增殖活性高，也表明化療藥物對(duì)膠質(zhì)瘤患者較為敏感，化療效果較好。綜合顯示，TOPⅡ靶向藥物對(duì)TOPⅡ高表達(dá)患者可能更有效地提高生存期限，延緩生命，同時(shí)TOPⅡ基因檢測(cè)對(duì)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后預(yù)測(cè)和臨床化療藥物的選擇提供有效指導(dǎo)。

IDH是檸檬酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，在維持機(jī)體正常代謝的過程中起到至關(guān)重要的作用。近年來在膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌、急性髓細(xì)胞性白血病等諸多惡性腫瘤中均發(fā)現(xiàn)了IDH1和IDH2突變。研究表明IDH1突變作為膠質(zhì)瘤的生物標(biāo)志物，可能提示更好的預(yù)后[10]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，IDH1陽(yáng)性患者中位生存期比陰性患者顯著延長(zhǎng)，IDH1陽(yáng)性患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是IDH1陰性患者的0.350倍。這可能與IDH1突變型腫瘤的低增殖率有關(guān)。研究表明[11]，IDH1突變能改變機(jī)體代謝和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其中糖酵解和脂質(zhì)代謝發(fā)生了很多改變，尤其是長(zhǎng)鏈脂酰COA合成酶1(ACSL1)的表達(dá)水平較低。癌癥基因組圖譜提示ACSL1水平越低，IDH1突變膠質(zhì)瘤患者預(yù)后越好[12]。另外，癌癥相關(guān)的慢性炎癥會(huì)引發(fā)不受控制的血小板活化，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)、血管生成、轉(zhuǎn)移和癌癥相關(guān)血栓形成[13]。腫瘤浸潤(rùn)性中性粒細(xì)胞增多、外周血中性粒細(xì)胞增多和中性粒細(xì)胞淋巴細(xì)胞比率升高也會(huì)導(dǎo)致預(yù)后不良[14]。而IDH1突變型膠質(zhì)瘤通過下調(diào)低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor, HIF)的表達(dá)，炎癥水平普遍較低，小血管生成和活化細(xì)胞數(shù)目減少，生存期往往延長(zhǎng)[15]?？傊琓OPⅡ和IDH1的表達(dá)水平反映了膠質(zhì)瘤轉(zhuǎn)歸的趨勢(shì)，可以作為判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后的指標(biāo)。

影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的因素較多，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，術(shù)后放化療和病理級(jí)別也是膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響因素。在腫瘤類型確定的情況下，腫瘤的病理級(jí)別越低，異型性就越小，腫瘤的侵襲性和進(jìn)展性潛能越低，通常療效反饋越好，相應(yīng)預(yù)后越好。膠質(zhì)瘤患者術(shù)后放化療可加速術(shù)后恢復(fù)，延緩病情進(jìn)展，減少早期腫瘤轉(zhuǎn)移和減緩后期加速進(jìn)展，從而促進(jìn)患者康復(fù)和延緩生命。這與文中討論膠質(zhì)瘤病理級(jí)別高的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是病理級(jí)別低患者的5.231倍和術(shù)后放化療患者的死亡危險(xiǎn)是術(shù)后無放化療患者的0.205倍的結(jié)果相符。

綜上所述，TOPⅡ和IDH1與膠質(zhì)瘤病理級(jí)別有關(guān)，TOPⅡ陽(yáng)性患者生存期短，IDH1陽(yáng)性提示預(yù)后良好，因此，聯(lián)合檢測(cè)TOPⅡ和IDH1有利于判斷膠質(zhì)瘤惡性程度及預(yù)測(cè)患者生存期，進(jìn)而為膠質(zhì)瘤的診斷、預(yù)后判定和個(gè)性化治療提供有效的理論依據(jù)。