萬(wàn)承波，林黛琴，王婷婷，鐘永生，楊標(biāo)斌，黃磊

江西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)院（南昌 330029）

苯丁錫（Fenbutatin oxide）又名螨完錫，屬于一種有機(jī)錫農(nóng)藥，是一種殺螨劑，分子式為C60H78OSn2，對(duì)有機(jī)氯和有機(jī)磷產(chǎn)生抗性的螨類害蟲(chóng)能有效防治，被廣泛用于果蔬、茶樹(shù)等作物，易通過(guò)食物鏈進(jìn)入生物體內(nèi)產(chǎn)生生物富集，對(duì)人體和動(dòng)物有一定的毒性。目前我國(guó)、日本及歐盟等均對(duì)食品中的苯丁錫作出相應(yīng)的限量規(guī)定。我國(guó)在黃瓜、香蕉等蔬菜水果、堅(jiān)果類食品中均有限量規(guī)定，GB 2763—2019中限量范圍在0.5～10 mg/kg之間，推薦方法為SN 0592—1996《出口糧谷及油籽中苯丁錫殘留量》；日本肯定列表制度規(guī)定部分水果蔬菜中的苯丁錫殘留限量為0.05 mg/kg；歐盟關(guān)于苯丁錫使用限量規(guī)定最為嚴(yán)格，在蔬菜、谷物、牛奶雞蛋等動(dòng)物產(chǎn)品中的最大殘留限量為0.01 mg/kg。

目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的有機(jī)錫類農(nóng)藥的檢測(cè)分析方法主要有氣相色譜（FPD、ECD）法[1-5]、氣相色譜質(zhì)譜法[6-7]、液相色譜質(zhì)譜法[8-10]、液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法[11-12]、紅外光譜法[13]等。有機(jī)錫化合物沸點(diǎn)高，氣相色譜直接進(jìn)樣不能氣化，衍生反應(yīng)后還需要凈化才能進(jìn)樣，缺點(diǎn)主要集中在過(guò)程繁瑣、衍生條件苛刻以及存在不穩(wěn)定性且耗時(shí)費(fèi)力，難以實(shí)現(xiàn)通量檢測(cè)；目前我國(guó)對(duì)苯丁錫有限量值規(guī)定的包括蔬菜、水果、干制水果以及堅(jiān)果類，基質(zhì)種類較為復(fù)雜，采用紫外光譜法容易造成假陽(yáng)性的存在；采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法無(wú)需衍生、操作簡(jiǎn)便、節(jié)省溶劑、穩(wěn)定性好，適合高通量檢測(cè)。

檢索文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前報(bào)道的苯丁錫含量檢測(cè)方法的適用范圍局限在蔬菜、水果、糧谷、畜禽肉中，尚未有堅(jiān)果類中苯丁錫含量的檢測(cè)方法報(bào)道，油脂油料基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等干擾物，建立一種液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定堅(jiān)果類中苯丁錫含量的分析方法很有必要。此次試驗(yàn)擬針對(duì)堅(jiān)果類基質(zhì)，選取比較有代表性的杏仁、核桃仁為研究對(duì)象，建立一種簡(jiǎn)便、快速且準(zhǔn)確度高的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Waters-UPLC I-Class高效液相色譜儀，AB SCIEX TRIPLE QUAD 5500質(zhì)譜儀；空氣控溫?fù)u床儀KS400i；離心機(jī)3K15（Sigma）；電子天平（感量0.1 mg，Sartorius，德國(guó)）；渦旋振蕩儀（IKA）。

苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)品（純度98.0%，Bepure）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA，40～60 μm，安捷倫，美國(guó)）；十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18，40～60 μm，安捷倫，美國(guó)）；乙酸銨（色譜級(jí)，阿拉丁公司）；無(wú)水硫酸鎂（分析純，廣州化學(xué)試劑）；氯化鈉（分析純，廣州化學(xué)試劑）；甲酸（色譜級(jí)，阿拉丁公司）；乙腈、正己烷（色譜純，默克爾公司）。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱，Waters BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μ m）；柱溫，40 ℃；流動(dòng)相A，5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水；流動(dòng)相B，甲醇；流速，0.4 mL/min。梯度洗脫程序：0～0.3 min，10% B；0.3～2 min，10%～100%B；2～5 min，100% B；5～5.1 min，100%～10% B；5.1～6 min，10% B。進(jìn)樣體積：2 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源，電噴霧離子源（ESI）；掃描方式，正離子模式；離子源溫度，550 ℃；CUR，0.207 MPa；IS，5 500 V；GS1，0.379 MPa；GS2，0.379 MPa。掃描模式：多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)MRM模式，見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜條件

1.3 測(cè)定步驟

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

苯丁錫儲(chǔ)備液的配制：準(zhǔn)確稱取25.0 mg苯丁錫于250 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即得到100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于4 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理

稱取4.0 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL塑料離心管中，加入20 mL正己烷飽和的乙腈，以300 r/min振蕩提取40 min，加入4.0 g無(wú)水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉，劇烈振蕩2 min，離心分層。取2 mL上清液至加有40 mg C18粉的2.5 mL離心管中，渦旋1 min，離心3 min。準(zhǔn)確移取1 mL上清液，于40 ℃氮吹至近干，用1 mL乙腈-0.1%甲酸水（3∶2，V/V）定容，過(guò)膜上機(jī)待測(cè)。

1.3.3 定性及定量測(cè)定

以樣品中目標(biāo)化合物色譜峰的保留時(shí)間和相應(yīng)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)色譜峰的保留時(shí)間比較，誤差絕對(duì)值應(yīng)不超過(guò)2.5%。為減少基質(zhì)對(duì)目標(biāo)物定量測(cè)定的影響，該方法采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線-外標(biāo)法定量測(cè)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液采用基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器方法優(yōu)化

2.1.1 流動(dòng)相種類以及流速的優(yōu)化

分別考察了0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-乙腈以及0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-甲醇2種流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示，同等濃度的苯丁錫標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-乙腈體系中響應(yīng)低且色譜峰展寬。分析原因：乙腈的洗脫能力比甲醇強(qiáng)，同等比例的乙腈和甲醇，含乙腈的溶解液會(huì)導(dǎo)致峰展寬現(xiàn)象更為嚴(yán)重，且甲醇提供質(zhì)子的能力比乙腈強(qiáng)，甲醇更適合正離子監(jiān)測(cè)模式，最終采用0.1%甲酸水（5 mmol/L乙酸銨）溶液-甲醇的流動(dòng)相體系。

進(jìn)一步對(duì)流動(dòng)相流速進(jìn)行優(yōu)化，考察了0.3，0.4和0.5 mL/min三種流速。結(jié)果顯示，當(dāng)流速增加至0.4 mL/min后，苯丁錫的峰寬無(wú)明顯變化。此外，出于對(duì)儀器以及色譜柱的保護(hù)，最終選擇0.4 mL/min的流速。

2.1.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

此次試驗(yàn)采用針泵流動(dòng)注射進(jìn)樣，在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子掃描，從圖1中可見(jiàn)其存在多簇離子峰，與儀器自帶軟件功能Isotopic distribution得出的同位素分布豐度圖吻合，已報(bào)道的液相色譜質(zhì)譜法均采用517.2作為母離子，此次試驗(yàn)創(chuàng)新性地選取響應(yīng)最強(qiáng)的519.2（C30H39Sn-）作為母離子。苯丁錫分子式為C60H78OSn2，錫含有10個(gè)穩(wěn)定的同位素（質(zhì)量數(shù)分別為112，114，115，116，117，118，119，120，122和124）[14]，其中120（Sn）的豐度最大，這進(jìn)一步解釋了選取519.2作為苯丁錫母離子的合理性，故選擇響應(yīng)較強(qiáng)的519.2作為母離子。進(jìn)一步進(jìn)行子離子掃描（Product ion scan），選擇463.1，351.0和196.8為子離子（圖2）。選擇517.2作為母離子，進(jìn)一步掃描子離子并優(yōu)化碰撞能（CE）、去簇電壓（DP）等參數(shù)，采用MRM模式進(jìn)樣，雖然也可以滿足靈敏度要求，但選用519.2作為母離子靈敏度更高，更有利于方法研究。

2.2 前處理方法優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑選擇

此次試驗(yàn)對(duì)象為堅(jiān)果類基質(zhì)，其富含油脂和蛋白，苯丁錫為極性分子，難溶于大多數(shù)有機(jī)溶劑；分別考察了正己烷、乙腈、正己烷飽和的乙腈為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)正己烷提取效率最低，乙腈和正己烷飽和的乙腈最好，但是正己烷飽和的乙腈提取到的干擾物質(zhì)更少，主要是因?yàn)闃悠坊|(zhì)富含油脂緣故。最終選取正己烷飽和的乙腈作為提取溶劑。

2.2.2 除水劑用量的選擇

無(wú)水硫酸鎂相較無(wú)水硫酸鈉具有更好的吸水能力，考察了1，2，3，4和5 g無(wú)水硫酸鎂對(duì)苯丁錫提取回收率的影響。隨著無(wú)水硫酸鎂用量的增加，回收率逐漸提高，當(dāng)用量大于4 g時(shí)，苯丁錫回收率逐漸下降，故最終選擇添加4 g無(wú)水硫酸鎂。

2.2.3 凈化材料的選擇

目前農(nóng)藥殘留測(cè)定中運(yùn)用比較廣泛的分散固相萃取凈化材料主要有石墨炭黑（GCB）、乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅膠鍵合相（C18）等，此次試驗(yàn)主要考察以上3種凈化材料比例用量對(duì)目標(biāo)物提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加入GCB、PSA凈化后，樣品中苯丁錫回收率明顯下降。分析原因是苯丁錫為多苯環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)，石墨炭黑是平面結(jié)構(gòu)材料，相似相溶，可能導(dǎo)致苯丁錫被吸附從而導(dǎo)致回收率下降；乙二胺-N-丙基硅烷對(duì)苯丁錫有吸附，可能是由于分子間的作用力。C18粉對(duì)于小極性和非極性干擾物具有很好的吸附作用，可吸附脂肪等干擾物，堅(jiān)果類基質(zhì)的干擾物主要是蛋白質(zhì)和脂肪，進(jìn)一步對(duì)C18用量做了優(yōu)化。將1.2.1前處理提取液分別用10，20，40，60和100 mg C18粉進(jìn)行凈化，結(jié)果顯示，當(dāng)C18粉用量大于40 mg時(shí)，回收率逐漸降低（圖3）；故C18粉的最佳用量為40 mg。

圖1 苯丁錫全掃質(zhì)譜圖-同位素分布圖

圖3 不同質(zhì)量C18粉用量對(duì)苯丁錫回收率影響

2.3 線性范圍和定量限

準(zhǔn)確稱取4.0 g陰性樣品，按照1.2.1處理方法處理，制得若干基質(zhì)空白提取液，并以之逐級(jí)稀釋得到一系列質(zhì)量濃度（0.10，0.20，0.50，1.00，2.00和5.00 ng/mL），以苯丁錫定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為Y=6.8×104X+1.2×105（r=0.999 4）。定量限以10倍S/N計(jì)算，該方法定量限為0.50 μg/kg。

2.4 回收率和精密度試驗(yàn)

采用1.2.1前處理方法，分別在杏仁、核桃仁中添加不同濃度水平的苯丁錫進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。該方法的回收率均在81.7%～89.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.10%～4.56%之間。

表2 方法回收率和精密度

3 結(jié)論與討論

此次試驗(yàn)建立了液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定堅(jiān)果類中苯丁錫的檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)便、靈敏度高，定量限可達(dá)0.50 μg/kg，適用于堅(jiān)果中苯丁錫的定性、定量檢測(cè)。此次試驗(yàn)彌補(bǔ)了堅(jiān)果類中苯丁錫檢測(cè)方法的缺失，同時(shí)也為苯丁錫相關(guān)液質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)方法的制定提供參考。