□ 夏 瀾 嵊州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心

肉類(lèi)是人類(lèi)獲取蛋白質(zhì)的主要來(lái)源之一，其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)是維持人類(lèi)生命活動(dòng)所必需的。從蛋白質(zhì)水平和核酸水平上對(duì)肉類(lèi)成分進(jìn)行分析已經(jīng)成為解決肉類(lèi)摻假問(wèn)題的主要手段。在蛋白水平上，常常通過(guò)液相色譜、ELISA（酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)）以及高效液相色譜等對(duì)樣品的成分進(jìn)行分析。但這類(lèi)方法在檢測(cè)加工樣品時(shí)的特異性、準(zhǔn)確性較差，且對(duì)檢測(cè)樣品的處理和儀器的要求較高。在核酸水平上進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于DNA 的穩(wěn)定性和特異性可以較為準(zhǔn)確的對(duì)待測(cè)樣品的成分進(jìn)行分析。目前這類(lèi)檢測(cè)方法中的DNA探針雜交、普通PCR、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性擴(kuò)增以及熒光定量PCR 在肉類(lèi)來(lái)源的檢測(cè)中應(yīng)用的較多[1—4]。

1 熒光定量PCR 技術(shù)的檢測(cè)原理

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）最早是KaryMullis 在分析疾病基因時(shí)發(fā)明的[5]。而熒光定量PCR 技術(shù)是在普通PCR 的基礎(chǔ)上，將能夠發(fā)出熒光信號(hào)的探針或染料與引物一起加入到反應(yīng)體系中，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行半保留復(fù)制，通過(guò)對(duì)熒光信號(hào)的收集達(dá)到實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR 過(guò)程的目的[6]。該方法在封閉的體系中進(jìn)行擴(kuò)增和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，無(wú)需電泳就能得出結(jié)果，且在一定程度上避免了檢測(cè)樣品之間的交叉污染。同時(shí)，熒光定量PCR 的模板序列較短，可以縮短檢測(cè)時(shí)間，快速得到檢測(cè)結(jié)果。而根據(jù)產(chǎn)生熒光信號(hào)方式的不同，熒光定量PCR 技術(shù)可分為T(mén)aq Man 探針?lè)ê蚐YBR Green I 熒光染料法。

2 熒光定量PCR 技術(shù)在肉制品檢測(cè)過(guò)程中的應(yīng)用

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)肉制品肉源的檢測(cè)主要是檢測(cè)動(dòng)物細(xì)胞中線粒體相關(guān)基因。眾所周知，線粒體DNA 是細(xì)胞質(zhì)遺傳的，具有含量多、分裂快等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)不同組織部位中線粒體DNA 的含量具有很大的差異。因此對(duì)肉制品中肉種類(lèi)以及數(shù)量的檢測(cè)通常選用線粒體基因。此外，相比較核基因，線粒體基因的檢測(cè)具有較高的靈敏度和穩(wěn)定性。常用作檢測(cè)肉類(lèi)來(lái)源的線粒體基因主要是細(xì)胞色素b 基因、細(xì)胞色素c 氧化酶亞基基因和線粒體D—loop 區(qū)域的基因[4，7]。

2.1 TaqMan 探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)

肉制品的鑒定主要依靠蛋白質(zhì)檢測(cè)和基因檢測(cè)這兩種方法，相比較基因，蛋白質(zhì)在食品的加工過(guò)程中易受到高溫、高壓等加工條件的影響，而脫氧核糖核酸具有更好的熱穩(wěn)定性。另一方面，食品中動(dòng)物性成分的DNA序列的保守性更強(qiáng)，且其在提取過(guò)程中基本不受外界環(huán)境以及加工過(guò)程的影響。在混雜著牛肉、雞肉以及豬肉的混合肉類(lèi)中，使用TaqMan 探針能夠有效檢測(cè)到豬肉成分，且最低的極限為0.1 pg。除了單一食品的檢測(cè)，在摻雜其他原料的混合肉制品檢測(cè)過(guò)程中，這種方法也具有較強(qiáng)的檢測(cè)效率。研究人員對(duì)市場(chǎng)上銷(xiāo)售的包括牛肉干、火腿、香腸在內(nèi)的22 種常見(jiàn)的肉類(lèi)加工產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)這些肉制品中均能夠檢測(cè)到豬肉特異基因的熒光信號(hào)，這表明這些肉類(lèi)商品中均含有豬肉的成分，可能存在摻假。同一種肉制品不同批次的檢測(cè)結(jié)果也存在著較大的差異，這可能是由于不同組織肉中核酸的提取量不同[3—4]。

2.2 熒光染料實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)

與設(shè)計(jì)引物探針相比，DNA 復(fù)制過(guò)程中熒光染料嵌入到DNA 分子中具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。使用SYBR Green I 染料對(duì)市場(chǎng)上售賣(mài)的豬肉樣品的最低檢測(cè)極限在0.1 ng 左右。相似的結(jié)果也被其他的研究人員發(fā)現(xiàn)，如使用Eva Green 染料對(duì)加工肉制品中是否存在豬肉進(jìn)行分析，檢測(cè)結(jié)果顯示這種方法也能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出生肉制品和熟肉制品中豬肉的含量。除了對(duì)檢測(cè)樣品中摻雜的肉類(lèi)進(jìn)行定量的檢測(cè)外，該方法還能進(jìn)行定性檢測(cè)。如研究人員使用熒光染料對(duì)市售牛肉中是否含有馬肉進(jìn)行定量和定性的分析，結(jié)果顯示使用熒光染料能夠檢測(cè)到的最低值為0.1 pg。這些結(jié)果表明熒光染料熒光定量PCR 技術(shù)在定量和定性檢測(cè)肉類(lèi)來(lái)源方面發(fā)揮重要作用[4，8—9]。

3 展望

雖然熒光定量PCR 技術(shù)在肉制品種類(lèi)以及食品安全檢測(cè)方面有著不可替代的優(yōu)勢(shì)，但該技術(shù)目前在應(yīng)用上仍然存在一些問(wèn)題。如肉制品的加工過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致DNA 鏈的斷裂，并在擴(kuò)增過(guò)程中產(chǎn)生交叉污染，熒光探針或染料的價(jià)格較高等都會(huì)影響其應(yīng)用及檢測(cè)效果。因此，應(yīng)進(jìn)一步研究熒光定量PCR 技術(shù)與其他技術(shù)的結(jié)合，將其更好地應(yīng)用到肉制品的檢測(cè)工作中。