俞 超 胡攀婧 蔡旭正 沈 磊 周曉玲 王榮兵 汪財生

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

花生(ArachishypogaeaL.)為雙子葉植物，富含脂肪、糖類、蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，且花生仁中富含油脂，也是一種重要的油料作物，在全球范圍內(nèi)廣泛種植?；ㄉ鞍讓儆谫A藏蛋白，按其溶解性可分為水溶性蛋白和鹽溶性蛋白，水溶性蛋白主要為花生2S清蛋白，約占21%；鹽溶性蛋白主要包括花生球蛋白和伴花生球蛋白，約占79%[1]。對50份花生種質(zhì)中的貯藏蛋白的分析結(jié)果表明，球蛋白顯示出最大的多樣性(77.2%)，其次是清蛋白(52.3%)，表明種子蛋白質(zhì)組分可以作為評估花生種質(zhì)間變異性的重要標(biāo)記[2]?；ㄉ鞍椎奶崛》椒òɡ鋬龀恋矸╗3]、堿提酸沉法[4]和硫酸銨沉淀法[5]。硫酸銨沉淀法通過調(diào)節(jié)硫酸銨濃度，沉淀不同顆粒大小的蛋白，且蛋白在硫酸銨中較穩(wěn)定，是應(yīng)用較廣泛的蛋白組分分離方法。目前關(guān)于花生種子中的不同蛋白組分的研究少有報道，尤其是水溶性清蛋白。

植物清蛋白是一類沉降系數(shù)為2的混合貯藏蛋白，分子量范圍為10～20 kDa[6]，有10～12個亞基[7]，氨基酸成分中含有大量含硫氨基酸[8]，可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液，并可加熱固化。研究發(fā)現(xiàn)，植物種子清蛋白具有過敏原特性，如花生、芥菜、蓖麻、芝麻子、桃核及腰果等植物種子[8-9]。隨著研究的不斷深入，植物種子清蛋白其他的生物學(xué)活性也逐漸被發(fā)現(xiàn)，如抗細菌[10]、抗真菌[11-12]、DNA酶活[6]、胰蛋白酶抑制活性[13]、抗氧化[14]等，具有重要的價值和抗菌潛力，已成為生命科學(xué)研究的一個熱點。

植物蛋白抗氧化性可以保護組織免受氧化損傷，防止細胞老化；植物DNA酶對DNA的剪切催化是生命體必不可少的生化過程，DNA降解與生命體抵御外界病原微生物有密切關(guān)系[15-16]，DNA酶催化DNA降解的過程可依賴金屬離子，也可不依賴金屬離子?；ㄉ鞍谆钚匝芯總?cè)重于抗氧化肽[17]、抗菌肽[18]等，目前，有關(guān)花生清蛋白生物活性的研究甚少，其抗氧化性及DNA酶活性鮮有報道。本試驗從脫脂的花生粕中提取并純化獲得花生種子清蛋白，并研究其抗氧化、DNA酶活性，以期深入了解花生清蛋白在氧化應(yīng)激和免疫應(yīng)激系統(tǒng)中的作用，為獲得高效花生抗氧化肽和抗菌肽開拓新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用花生為山東產(chǎn)魯花9號，剝殼后烘干備用。

1,1-二苯基-2 -三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、2,6- 二叔丁基-4-甲基苯酚(butylated hydroxytoluene，BHT)、標(biāo)準(zhǔn)蛋白、pET28a質(zhì)粒，購于生物工程(上海)有限公司；其余常規(guī)生化試劑均為分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；AKTA Prime Plus蛋白層析系統(tǒng)、SE250垂直電泳槽，美國GE公司；5804R離心機，德國Eppendorf公司；BG-subMIDI水平電泳槽，北京百晶生物技術(shù)有限公司；Gel Dcode XR+凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；FW135粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 花生脫脂處理 將花生仁除外衣后放入中草藥粉碎機粉碎，按6 mL·g-1加入正己烷，混勻后置4℃冰箱過夜進行第一次脫脂處理。將脫脂后樣品抽濾，除去濾液，按3 mL·g-1再次加入正己烷，混勻，置4℃冰箱過夜進行第二次脫脂處理。取出二次脫脂后的花生樣品，抽濾風(fēng)干后即為脫脂花生粉，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 花生清蛋白的提取與初步分離 參照文獻[19]采用硫酸銨分級沉淀法。脫脂花生粉中加入磷酸緩沖溶液(pH值9.0)，液料比10∶1(mL·g-1)，60℃提取60 min，15 294×g離心20 min，上清液即為花生粗蛋白提取液。加入硫酸銨至飽和度45%，室溫靜置過夜，425×g離心20 min，取上清液于3 500 D透析袋4℃透析24 h后為一級沉淀花生清蛋白AHP1；向AHP1中加入硫酸銨粉末至飽和度65%，4℃靜置過夜，6 797×g離心20 min，取上清液3 500 D透析袋4℃透析24 h后為二級沉淀花生清蛋白AHP2； 向AHP2中加入硫酸銨粉末至飽和度85%，4℃靜置過夜，956×g離心20 min，取上清液4℃透析(3 500 D)24 h后為三級沉淀花生清蛋白AHP3。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)檢測所有蛋白樣品，并將蛋白樣品-40℃真空冷凍干燥48～36 h至粉末，保存于4℃冰箱。

1.3.3 花生清蛋白的純化 采用DEAE-52 (φ 2.0 cm×25 cm)陰離子交換柱純化清蛋白。2 g花生清蛋白凍干粉溶于50 mL 0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(含0.14 mol·L-1NaCl，pH值9.0)，上樣量3 mL，280 nm波長掃描吸收峰，收集純化后的清蛋白，SDS-PAGE電泳檢測其相對分子量。

1.3.4 花生清蛋白抗氧化性測定 DPPH自由基清除能力參照丁浩淼等[20]的方法測定，配制0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1花生清蛋白溶液，以無水乙醇為空白，于517 nm波長處測定吸光度值。按照公式計算DPPH自由基清除率(P)：

P=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

(1)

式中，A0為2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇的吸光度值；Ai為2 mL DPPH溶液與2 mL不同濃度的花生2S清蛋白的吸光度值；Aj為2 mL清蛋白溶液與2 mL無水乙醇的吸光度值。

羥基自由基清除能力參考Avellar等[21]的方法測定，以蒸餾水為空白，在510 nm波長處測量各濃度下的吸光度值。按照公式計算羥基自由基清除率：

羥基自由基清除率=(A0-Ax)/A0×100%

(2)

式中，A0為空白對照組的吸光度值，Ax為加入樣品后的吸光度值。

抗氧化性試驗均以抗氧化劑BHT為陽性對照。

1.3.5 花生清蛋白DNA酶活性測定 參考Tomar等[22]的方法測定。用50 mmol·L-1Tris-HCl(pH值7.4)緩沖液將花生2S清蛋白分別稀釋至0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1，取各濃度的清蛋白15 μL，分別與5 μL的0.1 mg·mL-1pET28a質(zhì)?；旌?，37℃條件下保溫2 h后進行電泳試驗，觀察DNA條帶。以Tris-HCl緩沖液和質(zhì)粒的混合液為對照。

配制濃度為100 mmol·L-1一價金屬離子KCl、NaCl溶液，以及濃度為10 mmol·L-1的二價金屬離子MgCl2、CaCl2溶液。取5 μL pET28a質(zhì)粒、10 μL 0.1 mg·mL-1清蛋白、5 μL金屬離子溶液制成混合液，37℃保溫2 h后進行電泳試驗，觀察DNA條帶。以質(zhì)粒、清蛋白混合液為對照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007 軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用Origin 9.0軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生清蛋白的提取

由圖1可知，45%硫酸銨沉淀所得AHP1蛋白種類較多，且既有大于97.4 kDa的大分子量蛋白，也有小于20 kDa的小分子量蛋白，不能完全分離出清蛋白。經(jīng)85%硫酸銨沉淀所得AHP3蛋白中，有小于20 kDa的小分子量蛋白，但濃度較低，且分子量在66.2 kDa左右的雜蛋白濃度較高，可能是伴花生球蛋白。65%硫酸銨所得AHP2蛋白，分子量幾乎都介于14.4～20 kDa之間，與清蛋白分子量范圍相符，且其他雜蛋白含量較少，因此選用AHP2蛋白樣品進行下一步的純化。

注：MK：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：AHP1；2：AHP2；3：AHP3。Note：MK：Marker. 1:AHP1. 2:AHP2. 3:AHP3.圖1 分級沉淀分離花生蛋白電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of of protein separated from Arachis hypogaea L. by fractional precipitation

2.2 花生清蛋白的純化

DEAE-52柱純化后的花生清蛋白出現(xiàn)一個明顯吸收峰(圖2)，電泳顯示在14.4～20.0 kDa分子量范圍內(nèi)有3條較清晰條帶(圖3)，利用相對遷移率計算得到其相對分子質(zhì)量分別為 14.5、15.5、17.2 kDa。

圖2 DEAE-52柱純化花生清蛋白Fig.2 Purification of albumin of Arachis hypogaea L. by DEAE-52 column

注：MK：標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1：純化后的花生清蛋白。Note：MK: Marker. 1: Purified peanut albumin.圖3 純化后花生清蛋白電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified albumin of Arachis hypogaea L.

2.3 花生清蛋白的抗氧化性

由圖4可知，花生清蛋白濃度從0.02 mg·mL-1增加到0.10 mg·mL-1時，其DPPH自由基清除率從26.3%升至45.0%左右，DPPH自由基清除活力與花生清蛋白濃度呈正相關(guān)，不同BHT濃度對DPPH自由基清除率影響不大，保持在80%左右。由圖5可知，花生清蛋白對羥基自由基清除活力與花生清蛋白濃度也呈明顯正相關(guān)，當(dāng)其蛋白濃度從0.02 mg·mL-1增加至0.10 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除率從10.8%增加至93.5%；當(dāng)花生清蛋白濃度大于0.06 mg·mL-1時，對羥基自由基的清除率超過了BHT。

圖4 花生清蛋白對DPPH自由基清除活力Fig.4 DPPH radical scavenging activity of albumin of Arachis hypogaea L.

圖5 花生清蛋白對羥基自由基清除活力Fig.5 Hydroxyl scavenging activity of albumin of Arachis hypogaea L.

2.4 花生2S清蛋白的DNA酶活性

由圖6可知，電泳圖中質(zhì)粒3條帶分別顯示開環(huán)型、線型、閉合環(huán)型3種構(gòu)型，隨著花生清蛋白濃度的升高，質(zhì)粒條帶逐漸變暗；當(dāng)清蛋白濃度為0.8 mg·mL-1時，質(zhì)粒條帶完全消失，產(chǎn)生降解后的小分子DNA拖帶。表明花生清蛋白DNA酶活性與其濃度有關(guān)，濃度越高降解效果越好。

注：1:CK；2～6:花生清蛋白濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1。Note：1: CK. 2-6: 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mg·mL-1albumin.圖6 蛋白濃度對花生清蛋白DNA酶活性的影響Fig.6 Effect of protein concentration on DNase degradation activity of albumin of Arachis hypogaea L.

2.5 金屬離子對花生2S清蛋白DNA酶活性的影響

由圖7可知， Ca2+、Mg2+、K+、Na+4種金屬離子均有增強清蛋白DNA酶活性的作用，尤其在二價金屬離子Ca2+、Mg2+的促進作用下，質(zhì)粒條帶徹底降解；而一價金屬離子K+、Na+并未促進花生清蛋白完全降解質(zhì)粒，質(zhì)粒條帶仍可見。比較質(zhì)粒條帶及降解后小分子量DNA條帶的亮度，4種金屬離子增強清蛋白DNA酶活性的能力由大到小依次是Mg2+>Ca2+>Na+>K+。

注：1：CK; 2～5: 花生清蛋白樣品中依次加入Ca2+、Mg2+、K+、Na+。Note：1: CK. 2-5：Mixture added Ca2+、Mg2+、K+、Na+ in sequence.圖7 金屬離子對花生清蛋白DNA酶活性的影響Fig.7 Effect of metal ions on DNase activity of albumin of Arachis hypogaea L.

3 討論

硫酸銨分級沉淀法中硫酸銨的濃度是分離蛋白的關(guān)鍵，此法已應(yīng)用于各種植物種子蛋白的提取。該方法用于提取枸杞蛋白，40%硫酸銨濃度是枸杞的最佳提取條件[23]。落葵種子蛋白提取工藝優(yōu)化試驗中，95%飽和硫酸銨沉淀效果最好[24]。硫酸銨分級沉淀法是一種分離富硒大豆蛋白組分的有效方法，且60%硫酸銨較佳[25]。用90%飽和硫酸銨從扁豆種子中提取的清蛋白的分子量為26.5 kDa[26]，說明植物蛋白提取的最適硫酸銨飽和度與不同來源蛋白的溶解度有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，采用65%硫酸銨分離花生清蛋白的效果最好，且純化后的花生清蛋白電泳結(jié)果表明其有3個亞基，相對分子質(zhì)量均小于20 kDa，與巴西堅果分子量(12 kDa)相似[27]。硫酸銨分級沉淀法步驟簡便、效果明顯，適合分離小分子量花生清蛋白，且能夠較好地保留花生清蛋白的活性。

花生清蛋白在清除DPPH自由基和羥基自由基中均表現(xiàn)出較強的能力?；ㄉ宓鞍譊PPH自由基清除能力與蕎麥清蛋白相當(dāng)，但花生2S清蛋白的羥基自由基清除效果更佳[28]。本試驗中花生清蛋白的自由基的清除能力與其蛋白濃度呈正相關(guān)，這一結(jié)果與火龍果籽清蛋白抗氧化特性一致[29]。最新研究發(fā)現(xiàn)，花生葉中可溶性蛋白也具有抗氧化性[30]，其DPPH自由基清除能力高于花生清蛋白，但羥基自由基清除能力弱于花生清蛋白。

花生清蛋白具有DNA酶活性，可降解DNA，Ca2+、Mg2+、Na+、K+金屬離子均可增強花生清蛋白的DNA酶活性。這是繼葫蘆科南瓜[22]、夾竹桃科靛木[31]后，首次在豆科植物花生的清蛋白中發(fā)現(xiàn)有DNA酶活性，這可能是小分子量的清蛋白所特有的功能。已知Mg2+對多種酶活力都有促進作用，如DNA聚合酶、磷酸酶等，廣泛參與生物體各種能量物質(zhì)代謝。本研究中Mg2+也是花生清蛋白最佳的DNA酶活促進劑，這可能與其蛋白結(jié)構(gòu)性質(zhì)有關(guān)，具體機理有待進一步研究。此外，花生粕中含豐富的蛋白質(zhì)[32-33]，下一步可深入研究蛋白結(jié)構(gòu)與功能間的關(guān)系，從蛋白組學(xué)層面挖掘更多有開發(fā)利用價值的活性功能，為花生的產(chǎn)品開發(fā)、高值化利用提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗從花生粕中分離純化得到花生清蛋白，電泳結(jié)果表明，其由3個亞基組成，相對分子質(zhì)量分別為 14.5、15.5、17.2 kDa。花生清蛋白具有體外抗氧化性及DNA酶活性，且Ca2+、Mg2+、K+、Na+4種金屬離子均能增強清蛋白DNA酶活性，DPPH自由基和羥基自由基清除活力均與清蛋白濃度呈正相關(guān)。