韓妙華 滕瑞敏 李 輝 劉 昊 林士佳 莊 靜

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院/茶葉科學(xué)研究所，江蘇 南京 210095)

茶樹(shù)[Camelliasinensis(L.) O. Kuntze]作為一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國(guó)已有幾千年的栽培歷史。我國(guó)茶區(qū)分布較廣，地形復(fù)雜，且茶樹(shù)具有喜濕耐蔭、喜溫懼寒的特性，在引種和栽培過(guò)程中，鹽堿、高溫、干旱、強(qiáng)光等各種非生物脅迫嚴(yán)重影響茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，降低茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。非生物脅迫下，轉(zhuǎn)錄因子脅迫相關(guān)蛋白合成，在植物逆境信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[2]。

轉(zhuǎn)錄因子是一種能夠與DNA啟動(dòng)子區(qū)域相互作用的蛋白質(zhì)，抑制或激活其他基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)[3]。干旱應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DRE-binding protein，DREB)屬于APETALA2/ethylene responsive foutor(AP2/ERF)轉(zhuǎn)錄因子家族，主要參與植物多種生理生化反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，如對(duì)逆境(低溫、干旱、鹽漬)、激素、病害等的應(yīng)答[4]。DREB轉(zhuǎn)錄因子存在1個(gè)保守的DNA結(jié)合域AP2，能夠與脫水響應(yīng)元件(dehyaration responsive element，DRE)或CRT(C-repeat)等順式作用元件結(jié)合，部分成員能特異性地結(jié)合其基因上游GCC-box元件或耦合元件(coupling element, CE1)，從而促進(jìn)或抑制低溫、高鹽、干旱等相關(guān)基因表達(dá)。DRE核心序列元件TACCGACAT調(diào)節(jié)脫落酸(abscisic acid, ABA)獨(dú)立途徑，可以不依賴ABA在逆境脅迫下完成抗性調(diào)節(jié)[2]。DREB蛋白堿性核定位信號(hào)區(qū)位于N端，酸性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)位于C端，中間是AP2結(jié)構(gòu)域，由57～70個(gè)氨基酸殘基組成，含有RAYD和YRG保守序列塊。RAYD元件存在一個(gè)由18個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的核心序列，形成1個(gè)雙親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，可能參與AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子與其他轉(zhuǎn)錄因子或DNA的相互作用；YRG元件具有保守的YRG氨基酸基序。AP2結(jié)構(gòu)域第2個(gè)β-折疊中第14和第19位氨基酸殘基存在差異，決定了AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子能夠與不同順式作用元件特異性結(jié)合。

植物中DREB轉(zhuǎn)錄因子最早在擬南芥中分離得到[5]。Liu等[6]從擬南芥的cDNA文庫(kù)中克隆了5個(gè)與DRE元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子(DREB1A、DREB1B、DREB1C、DREB2A以及DREB2B)。隨后，在水稻[7]、棉花[8]、胡蘿卜[9]、大白菜[10]、巴哈雀稗[11]等物種中均克隆得到DREB基因。在擬南芥中，DREB亞族被分為6個(gè)亞組(A1～A6)，DREB1/CBF和DREB2蛋白分別歸入A1和A2亞組[12]。DREB-A1亞組基因響應(yīng)低溫誘導(dǎo)；DREB-A2亞組與植物在高鹽、干旱下的逆境耐受性有關(guān)，其他4個(gè)亞組基因響應(yīng)其他非生物脅迫誘導(dǎo)。已有研究證明，水稻、擬南芥、煙草DREB基因過(guò)表達(dá)可能使種子在發(fā)芽期間降低對(duì)高鹽的敏感性，并促進(jìn)根的早期生長(zhǎng)[13]。過(guò)表達(dá)菊花DmDREBa和DmDREBb能夠提高轉(zhuǎn)基因煙草耐寒性，DmDREBb還可加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物在高鹽下的耐受性[14]。齒肋赤蘚ScDREB10過(guò)表達(dá)顯著提高擬南芥種子在滲透和鹽脅迫下的發(fā)芽率，提高了活性氧的清除能力[15]。

目前，茶樹(shù)中DREB轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用機(jī)理尚不清楚，因此，研究茶樹(shù)CsDREB-A2基因在非生物脅迫下的表達(dá)情況，對(duì)于進(jìn)一步了解CsDREB轉(zhuǎn)錄因子的功能具有重要的作用。本研究以茶樹(shù)龍井43為材料，克隆得到1個(gè)編碼CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子的基因，對(duì)該基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行了序列比對(duì)、亞細(xì)胞定位、理化性質(zhì)、親水性和疏水性等方面的分析，并研究了其進(jìn)化樹(shù)、二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究了茶樹(shù)CsDREB-A2基因在低溫、高溫、干旱和高鹽脅迫下的響應(yīng)情況，旨在為進(jìn)一步研究茶樹(shù)CsDREB基因?qū)δ婢趁{迫的響應(yīng)機(jī)理提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

供試材料龍井43(Camelliasinensiscv. Longjing 43)二年生茶樹(shù)扦插幼苗，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶葉科學(xué)研究所。摘取龍井43無(wú)病蟲(chóng)害植株的幼嫩葉片為試驗(yàn)材料。

選取長(zhǎng)勢(shì)良好的龍井43盆栽幼苗，分別進(jìn)行高溫(38℃)、低溫(4℃)、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)和干旱[200 g·L-1聚乙二醇(polyethy lene glyco, PEG)]脅迫處理，處理時(shí)間分別為2、4、8和24 h，以未處理的植株作為對(duì)照(CK)，在各時(shí)間段采集不同處理的茶樹(shù)葉片。取樣時(shí)，每處理從50株龍井43茶樹(shù)群體中隨機(jī)選取5株健康植株，每株摘取一芽二葉初展葉片，全部進(jìn)行混樣。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取和cDNA合成 茶樹(shù)葉片總RNA提取方法參照北京華越洋生物科技有限公司Quick RNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)。RNA樣品濃度采NanoDrop ND 1000微量紫外檢測(cè)儀(上海譜元儀器有限公司)測(cè)定，采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量[16-17]。按照大連TaKaRa公司Prime Script RT Reagent Kit試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。

1.2.2CsDREB-A2基因的克隆 基于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)逆境生理課題組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[18]，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，上游引物CsDREB-A2-QF序列為5′-ATGATAGCTCAGAACATTGA-3′，下游引物CsDREB-A2-QR序列為5′-TTAAAGACCCAAATCTGAGTA-3′。PCR擴(kuò)增體系為20 μL，包含7 μL ddH2O、10 μL 2×TaqPlus Master Mix酶、1 μL cDNA模板、上下游引物各1 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min[19]。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，參照杭州維特潔生化技術(shù)公司DNA回收試劑盒說(shuō)明書(shū)將其回收，與pMD 19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH 5α中。挑取陽(yáng)性克隆菌液送至南京金斯瑞公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)預(yù)測(cè)序列保守域，并用BLAST進(jìn)行序列同源性比較[20]。利用DNAMAN 8.0軟件進(jìn)行氨基酸序列多重比對(duì)和親/疏水性分析。登陸SMS(http://www.bio-soft.net/sms)和ExPASy-ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)分析氨基酸序列組成及理化性質(zhì)[21]。利用FoldIndex網(wǎng)站(https://fold.weizmann.ac.il/fldbin/findex)分析氨基酸折疊無(wú)序化特性。蛋白亞細(xì)胞定位采用LocTree3(https://rostlab.org/services/loctree3)和SoftBerry ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)。擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白全長(zhǎng)序列登陸Tair(https://www.arabidopsis.org)下載，并利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)磷酸化位點(diǎn)?？缒そY(jié)構(gòu)和信號(hào)肽分別利用TMpred(https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)和SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)采用SOPMA在線網(wǎng)站(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行。登陸Swiss-Model(http://www.Swissmodel.expasy.org)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)[19]，并利用PyMOL軟件生成三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.2.4 茶樹(shù)CsDREB-A2基因的表達(dá)特性分析 提取非生物脅迫處理樣品的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。按照大連TaKaRa公司SYBR PremixExTaqKit試劑盒說(shuō)明書(shū)以及CFX96TMreal-time PCR system平臺(tái)完成熒光定量，分析CsDREB-A2基因在高溫、低溫、干旱、高鹽處理下茶樹(shù)中的表達(dá)情況。茶樹(shù)GAPDH基因作為內(nèi)參基因[22]。檢測(cè)目標(biāo)基因表達(dá)的引物為CsDREB-A2-qrtF(5′-TTAAAGACCCAAATCTGAGTA-3′)和CsDREB-A2-qrtR(5′-TTAAAGACCCAAATCTGAGTA-3′)。內(nèi)參基因的引物為CsGAPDH-JF(5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′)和CsGAPDH-JR(5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′)，采用2-ΔΔCT法[23]分析結(jié)果。采用IBM SPSS Statistic 25和Micosoft Office Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CsDREB-A2基因的克隆

以茶樹(shù)葉片cDNA為模板，通過(guò)引物CsDREB-A2-QF和CsDREB-A2-QR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1 000 bp左右的擴(kuò)增片段。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定與分析，結(jié)果顯示，茶樹(shù)CsDREB-A2基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 056 bp，共編碼351個(gè)氨基酸(圖1)，GenBank登錄號(hào)為MN082027。

圖1 茶樹(shù)CsDREB-A2基因核苷酸序列與推測(cè)的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide acid and deduced amino acid sequence of CsDREB-A2 gene in C. sinensis

2.2 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)分析

茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥AP2/ERF家族成員進(jìn)化分析結(jié)果顯示，茶樹(shù)CsDREB-A2屬于DREB亞族的A2組(圖2-A)。將其氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，CsDREB-A2 轉(zhuǎn)錄因子與獼猴桃(Actinidiachinensis)、葡萄(Vitisvinifera)等物種有較近的親緣關(guān)系，與梅花(Prunusmume)、甜櫻桃(Prunusavium)等物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖2-B)。

圖2 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)化樹(shù)(A)及與部分物種氨基酸序列進(jìn)化分析(B)Fig.2 Phylogenetic tree of CsDREB-A2 from C. sinensis (A) and phylogenetic analysis of amino acid sequences with some species (B)

2.3 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子與其他植物相關(guān)氨基酸序列比對(duì)

茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子保守域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖3-A)，AP2保守結(jié)構(gòu)域位于該轉(zhuǎn)錄因子第9～第154氨基酸位點(diǎn)之間，N端含有典型的保守YRG元件和WLG基序，其中AP2保守結(jié)構(gòu)域第14、第19位氨基酸分別為纈氨酸(V)和谷氨酸(E)。第254～第263氨基酸位點(diǎn)之間存在1個(gè)LM無(wú)序化區(qū)域(FDxxELLxxL)。將茶樹(shù)CsDREB-A2 氨基酸序列與其他物種DREB類轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示，茶樹(shù)與川桑(Morusnotabilis)、木豆(Cajanuscajan)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)等物種的DREB類轉(zhuǎn)錄因子相似性為52.56%(圖3-B)。

圖3 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子保守域(A)與其他物種氨基酸序列的多重比對(duì)(B)Fig.3 Conserved domains of CsDREB-A2 transcription factor (A) and multiple alignment of relative amino acid sequences in C. sinensis and other species (B)

2.4 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子氨基酸組成及理化性質(zhì)分析

由表1可知，DREB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白相對(duì)分子量在33.78～44.25 kDa之間，蛋白殘基數(shù)為304～402，理論等電點(diǎn)為4.63～5.32。不同植物中各氨基酸種類所占比例不同，其中酸性氨基酸所占比例普遍高于堿性氨基酸，脂肪族氨基酸高于芳香族氨基酸；蛋白質(zhì)總平均疏水性為-0.77左右，表現(xiàn)出較強(qiáng)的親水性。利用NetPhos 3.1對(duì)CsDREB-A2蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，該多肽鏈0.5以上分值的氨基酸位點(diǎn)為47個(gè)，其中包含29個(gè)絲氨酸(S)、12個(gè)蘇氨酸(T)和6個(gè)酪氨酸(Y)磷酸化位點(diǎn)。

2.5 茶樹(shù)CsDREB-A2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

CsDREB-A2蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CsDREB-A2蛋白主要定位于細(xì)胞核(表2)。在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站LocTree3對(duì)該蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析結(jié)果與SoftBerry ProtComp 9.0一致，由此推斷，茶樹(shù)CsDREB-A2蛋白主要在細(xì)胞核中發(fā)揮生物學(xué)作用。

2.6 茶樹(shù)CsDREB-A2蛋白氨基酸親、疏水性和無(wú)序化分析

CsDREB-A2蛋白氨基酸序列的親水性和疏水性分析結(jié)果顯示，該轉(zhuǎn)錄因子疏水性最強(qiáng)的位點(diǎn)是第351位亮氨酸(Leu)，其次是第261位甘氨酸(Gly)；親水性最強(qiáng)的是第34位精氨酸(Arg)，其次第33位賴氨酸(Lys)、第35～第37位賴氨酸、絲氨酸(Ser)、精氨酸；大部分氨基酸屬于親水性氨基酸(圖4)。利用FoldIndex對(duì)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行氨基酸序列折疊無(wú)序化分析，結(jié)果表明，該轉(zhuǎn)錄因子存在5個(gè)氨基酸無(wú)序化區(qū)域，共包含258個(gè)氨基酸，無(wú)序化比例為73.50%，無(wú)序化特征明顯(圖5)。

圖4 茶樹(shù)CsDREB-A2氨基酸序列疏水性和親水性分析Fig.4 Hydrophobicity and hydrophilicity of amino acid sequence of CsDREB-A2 in C. sinensis

表1 不同植物中DREB氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析Table 1 Analysis of composition and physicochemical properties of DREB amino acids in different plants

表2 CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Table 2 The prediction of subcellular localization of CsDREB-A2 transcription factor

注：正值表示蛋白的有序狀態(tài)，負(fù)值表示蛋白的無(wú)序狀態(tài)；下劃線標(biāo)注為有序狀態(tài)氨基酸，無(wú)下劃線標(biāo)注為無(wú)序狀態(tài)氨基酸。Note：The positive value indicates the ordered state of the protein，while the negative value indicates the disordered state of the protein.The underline indicates the ordered state of the amino acid，and the ununderlined indicates the disordered state of the amino acid.圖5 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子折疊狀態(tài)的分析Fig.5 Analysis of folding state of CsDREB-A2 transcription factor in C. sinensis

2.7 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)肽、跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析可知(圖6)，CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子mean S-score的值小于0.5，表明CsDREB-A2蛋白不存在信號(hào)肽序列，可能不屬于分泌蛋白。利用Tmpred在線網(wǎng)站進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，CsDREB-A2蛋白在269～285氨基酸位點(diǎn)之間存在1處由內(nèi)至外螺旋，分值為88，遠(yuǎn)低于500，不存在由外至內(nèi)螺旋，由此推測(cè)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子屬于非跨膜蛋白，沒(méi)有跨膜區(qū)域。

注：C-score：原始切割位點(diǎn)分值；S-score：信號(hào)肽分值；Y-score：綜合切割位點(diǎn)分值。Note：C-score：Raw cleavage site score. S-score：signal peptide score.Y-score：Combined cleavage site score.圖6 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.6 Signaling peptide prediction of CsDREB-A2 transcription factor in C. sinensis

2.8 茶樹(shù)CsDREB-A2蛋白推導(dǎo)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)與分析

由圖7可知，該轉(zhuǎn)錄因子的組成為30.77% α-螺旋、3.99% β-折疊、8.83%延伸主鏈及56.42%隨機(jī)卷曲。因此，CsDREB-A2主要由α-螺旋和隨機(jī)卷曲組成，β-折疊散布于蛋白序列中。

注：藍(lán)色：α-螺旋；紅色：β-折疊；綠色：β-轉(zhuǎn)角；粉色：隨機(jī)卷曲。Note：Blue：Alpha helix. Red：Extended strand. Green：Beta turn. Pink：Random coil.圖7 茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Prediction of secondary structure of CsDREB-A2 transcription factor in C. sinensis

采用Swiss-Model對(duì)CsDREB-A2 轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)建模分析，結(jié)果表明，其AP2結(jié)構(gòu)域含有1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊，且該結(jié)構(gòu)域第14位的纈氨酸和第19位的谷氨酸位于第2個(gè)β-折疊中，WLG基序存在于第3個(gè)β-折疊(圖8)。該轉(zhuǎn)錄因子三級(jí)結(jié)構(gòu)以隨機(jī)卷曲和α-螺旋為主，推測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)相吻合。

圖8 茶樹(shù)CsDREB-A2的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 The three-dimension structures of CsDREB-A2 in C. sinensis

2.9 茶樹(shù)CsDREB-A2基因在非生物脅迫下的表達(dá)情況

茶樹(shù)CsDREB-A2基因在4種脅迫下均能誘導(dǎo)表達(dá)，但是不同脅迫及不同處理時(shí)間下CsDREB-A2基因表達(dá)存在差異。在低溫脅迫下，CsDREB-A2基因的相對(duì)表達(dá)量呈先降低后上升隨后又降低的趨勢(shì)，在處理8 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大值，為CK的5.61倍，處理4、24 h時(shí)CsDREB-A2基因的相對(duì)表達(dá)量也明顯高于CK，分別為CK的1.74和4.39倍(圖9-A)。高溫和干旱脅迫下，CsDREB-A2基因相對(duì)表達(dá)量較CK表現(xiàn)出明顯的上調(diào)，分別在處理4 h和2 h時(shí)達(dá)到最大值，為CK的20.70倍和42.90倍(圖9-B、C)，其中高溫處理2、8、24 h時(shí)CsDREB-A2基因的相對(duì)表達(dá)量分別為CK的18.23、12.65、13.12倍；干旱處理8、24 h時(shí)CsDREB-A2基因的相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK，分別為CK的24.05、39.98倍。高鹽脅迫下茶樹(shù)CsDREB-A2基因的相對(duì)表達(dá)量在處理2、4、8 h表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)，處理2 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量最低，在處理24 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量顯著高于CK，為CK的2.05倍(圖9-D)。上述結(jié)果表明，茶樹(shù)CsDREB-A2基因參與高溫、低溫、高鹽、干旱等非生物脅迫應(yīng)答過(guò)程，對(duì)不同處理的響應(yīng)模式存在差異。

注：A：低溫；B：高溫；C：干旱； D：高鹽。不同小寫(xiě)字母表示在0.05水平上差異顯著。Note：A：Low temperature. B：High temperature. C：Drought. D：High salinity.Different lowercase letters indicate significate differences at 0.05 level.圖9 不同脅迫下茶樹(shù)CsDREB-A2基因在葉片中的相對(duì)表達(dá)量Fig.9 Relative expression of CsDREB-A2 gene in leaves of C. sinensis under different stress treatments

3 討論

本研究對(duì)比了茶樹(shù)CsDREB-A2基因在低溫(4℃)、高溫(38℃)、干旱(200 g·L-1PEG)和高鹽(200 mmol·L-1NaCl)脅迫下的表達(dá)特性，結(jié)果顯示，高溫和干旱脅迫均能快速誘導(dǎo)CsDREB-A2基因表達(dá)。推測(cè)該轉(zhuǎn)錄因子參與茶樹(shù)在高溫、干旱脅迫下的應(yīng)答過(guò)程。已有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥葉片AtDREB2A不響應(yīng)低溫脅迫，但受高溫脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[24]。大豆GmDREB2A基因在高溫、干旱脅迫下顯著上調(diào)[25]。在熱激反應(yīng)中，熱激引發(fā)擬南芥[26]和水稻[27]熱激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock transcription factor A1，HsfA1)激活，誘導(dǎo)DREB2A和HsfA2基因的轉(zhuǎn)錄；從而使得DREB2A與其靶基因HsfA3的啟動(dòng)子結(jié)合，激活HsfA3基因，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游熱激蛋白編碼基因的表達(dá)[28]。以上結(jié)果進(jìn)一步推測(cè)，CsDREB-A2可能參與高溫脅迫下茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄水平的熱激級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而調(diào)控茶樹(shù)應(yīng)答高溫和干旱脅迫。

擬南芥DREB2A蛋白中心區(qū)域包含一個(gè)負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域(NRD)，影響DREB2A轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和激活功能[29]。擬南芥AtDREB2A、大豆GsDREB2和向日葵HaDREB2A基因中的NRD結(jié)構(gòu)域都含有一段調(diào)控蛋白質(zhì)降解的PEST四肽序列(脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸)[30]。才華等[29]研究表明，野生大豆GsDREB2基因的負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域抑制GsDREB2的轉(zhuǎn)錄激活功能，導(dǎo)致GsDREB2不能與DRE元件特異性結(jié)合。人工突變野生大豆GsDREB2基因的負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域可獲得GsDREB2-mNRD基因，超量表達(dá)該基因的擬南芥顯著提高對(duì)鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性[29]。本研究茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子AP2結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活區(qū)存在絲氨酸(Ser)富集區(qū)域，推測(cè)CsDREB-A2基因可能存在NRD結(jié)構(gòu)域，降低該基因?qū)}脅迫的調(diào)節(jié)功能，使得CsDREB-A2基因在高鹽脅迫下表現(xiàn)出下調(diào)趨勢(shì)。ABA激活許多干旱脅迫基因的表達(dá)，這些基因啟動(dòng)子區(qū)包含保守的ABA順式反應(yīng)元件ABRE[31]。植物中，DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因啟動(dòng)子區(qū)域通常含有ABRE元件[30-31]。但茶樹(shù)CsDREB-A2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程中ABA的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步深入研究。

本研究中，茶樹(shù)CsDREB-A2氨基酸序列折疊無(wú)序化分析顯示，該轉(zhuǎn)錄因子無(wú)序化比例為73.50%，N-末端和C-末端固有無(wú)序化程度較高，這與Kragelund等[32]的研究一致。固有無(wú)序蛋白(intrinsic disordered proteins，IDPs)在天然狀態(tài)下不存在穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，但在行使生物學(xué)功能上具有重要作用。正常生長(zhǎng)條件下，DREB2A基因表達(dá)不會(huì)激活下游基因，DREB2A需要翻譯后修飾才能被激活，但是其激活機(jī)制尚不明確。無(wú)序結(jié)構(gòu)使IDPs比較靈活，含有豐富的結(jié)合位點(diǎn)，可對(duì)翻譯后修飾，如甲基化、磷酸化、乙?；冗M(jìn)行調(diào)控，同時(shí)在細(xì)胞生物信號(hào)多樣性功能方面起作用[33]。DREB2A轉(zhuǎn)錄因子中的LM區(qū)域可能介導(dǎo)該轉(zhuǎn)錄因子與自由基誘導(dǎo)細(xì)胞死亡蛋白1(radical induced cell death protein 1，RCD1)之間的相互作用[33]。N-末端部分無(wú)序區(qū)域與DREB2A相互作用蛋白1(DREB2A-interacting protein1，DRIP1)和DRIP2在細(xì)胞核發(fā)生互作，負(fù)調(diào)節(jié)干旱脅迫應(yīng)答反應(yīng)[32]。因此，這些固有無(wú)序蛋白主要參與分子識(shí)別、調(diào)控以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。但由于無(wú)序結(jié)構(gòu)在茶樹(shù)中的互作方式較為復(fù)雜，其具體反應(yīng)過(guò)程有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆得到的茶樹(shù)CsDREB基因?qū)儆贏P2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子中DREB亞族的A2組，與川桑、木豆、馬鈴薯等物種的DREB基因具有較高的同源性。CsDREB蛋白含有一個(gè)由60個(gè)氨基酸殘基組成的高度保守的結(jié)構(gòu)域AP2，YRG元件和WLG基序存在于該結(jié)構(gòu)域中，具有AP2/ERF家族轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。該結(jié)構(gòu)域第14和第19位氨基酸分別為纈氨酸和谷氨酸，起到與DRE/CRT作用元件結(jié)合的重要作用。本研究證實(shí)高溫和干旱脅迫可誘導(dǎo)茶樹(shù)CsDREB-A2基因表達(dá)，表明DREB類轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)非生物脅迫過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)結(jié)果為DREB類轉(zhuǎn)錄因子在茶樹(shù)抗逆脅迫的分子調(diào)控機(jī)制研究奠定了一定的理論基礎(chǔ)。