遲珺曦，雷文平,2，劉孝芳，劉成國,2*

1(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，湖南 長沙， 410128)2(湖南農(nóng)業(yè)大學 食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙， 410128)

益生發(fā)酵酸乳由于具備調(diào)節(jié)人體腸道菌群、緩解乳糖不耐癥、降膽固醇以及延緩衰老等功效[1]而深受消費者青睞。一般情況下，嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的混合菌株是酸奶發(fā)酵常用的主要菌種。發(fā)酵的過程中也可以添加雙歧桿菌、乳酸鏈球菌、干酪乳桿菌等[2]菌種。由于對干酪乳桿菌的研究不斷加強，人們也發(fā)現(xiàn)了其對人體健康的有益功效。比如對人體的免疫調(diào)節(jié)，在食品行業(yè)形成了重要地位。由于干酪乳桿菌具有耐酸、耐膽鹽能力強的特點，也常常單獨用于食品發(fā)酵中，其中發(fā)酵類乳制品較多[3]。如DIMITRELLOU等[4]在蘋果片和酪蛋白中添加凍干固定化干酪乳桿菌，將其接種到酸奶中發(fā)酵，這種新型的功能性酸奶產(chǎn)品在保藏的過程中保持了干酪乳桿菌的活力，酸奶的香氣和風味也得到了明顯的改善。又如，胡風林發(fā)現(xiàn)用青春雙歧桿菌和干酪乳桿菌發(fā)酵劑以2∶1接種，即可得到富硒酸奶[5]。

多數(shù)實驗用混合益生菌株來發(fā)酵酸乳，而用單一益生性干酪菌株發(fā)酵的較少。所以本研究采用已證明的具有益生特性的單一干酪乳桿菌，根據(jù)其耐熱、耐鹽性、最適溫度、產(chǎn)酸能力、產(chǎn)黏能力、后熟情況、最終所需求的發(fā)酵乳的特性等來確定選擇標準[6]。本實驗室對從湖南南山牧場牛奶中分離的,經(jīng)以往的實驗驗證為益生菌的1株干酪乳桿菌LC-7進行了研究，以確定其生物活性。且對該菌株的長期發(fā)酵特性進行了研究，得出了該菌株在功能性乳品開發(fā)中的重要結(jié)論，為開發(fā)功能性乳制品提供了科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干酪乳桿菌 (Lactobacilluscasei) LC-7，為湖南農(nóng)業(yè)大學實驗室篩選保藏，經(jīng)以往的實驗驗證，具有益生特性。MRS肉湯固(液)體培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；20%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛乳培養(yǎng)基(配制方法為：將20 g的脫脂乳粉溶于80 g去離子水中，于115 ℃條件下高溫滅菌20 min，滅菌后置于34 ℃條件下保存3 d，確認無菌后使用)；脫脂奶粉，澳優(yōu)-澳優(yōu)乳業(yè)(中國)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GZ-400-S恒溫培養(yǎng)箱，韶關(guān)市廣智科技設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D雙人單面垂直凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；BKQ-B7511壓力蒸汽滅菌器，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；FB224、NDJ-8S型黏度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；pH計，上海般特儀器有限公司；UV-1600PC型分光光度計、GCMS-QP2010型氣質(zhì)聯(lián)用儀，島津企業(yè)管理(中國)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 干酪乳桿菌的活化

在已滅菌好的MRS液體培養(yǎng)基中接種干酪乳桿菌種子液，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h并活化2次。

1.3.2 菌株的生長特性

1.3.2.1 干酪乳桿菌生長曲線的測定

將2%活化好的干酪乳桿菌接種于60 mL的MRS液體培養(yǎng)基中，試管分為5組，每組12支，分別間隔0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24 h，并分別于32、34、37、40、42 ℃下培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中按編號上的對應(yīng)時間將試管取出，使用紫外分光光度計測出的OD600nm值繪制生長曲線。

1.3.2.2 菌株耐鹽性測定

將活化的對數(shù)相菌液按2%的接種量(每組3個)接種于質(zhì)量分數(shù)為0%～7% NaCl的MRS液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h。用紫外分光光度計測定OD600nm值，評價菌株的耐鹽特性[7]。

1.4 干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵乳的制備

在800 g去離子水中加入200 g的脫脂乳粉，高溫滅菌20 min，溫度設(shè)定115 ℃，滅菌后于34 ℃條件下保存2 d，確認無菌后分裝到試管內(nèi)，按2%的接種量將LC-7菌液接種到裝有20%(質(zhì)量分數(shù))脫脂牛乳的試管中，混勻后于34 ℃條件下培養(yǎng)。

1.5 干酪乳酸菌的發(fā)酵特性

按照1.4制備發(fā)酵乳，分別在0、8、14、20、24 h取樣測定其 pH值、滴定酸度、黏度、活菌數(shù)、穩(wěn)定性等指標(每組做3個平行)，發(fā)酵后的乳樣在4 ℃冰箱中保存24 h，分別在放置0、8、14、18、20、24 h測定上述指標。

1.6 指標測定方法

1.6.1 測定酸乳pH值

利用pH計測定酸乳在不同發(fā)酵時間、貯藏時間下的pH值，并繪圖。

1.6.2 測定酸乳滴定酸度

參照GB/T 12456—2008測定酸乳在不同的發(fā)酵時間、貯藏時間下的滴定酸度，并繪圖。

1.6.3 測定酸乳黏度

利用 NDJ-8S 型數(shù)顯黏度計測定酸乳在不同的發(fā)酵時間、貯藏時間下的黏度，并繪圖(參數(shù)為1～2×106mPa·s)。

1.6.4 測定酸乳活菌數(shù)

將酸乳樣品利用無菌生理鹽水(質(zhì)量分數(shù)0.85% NaCl)稀釋得到7個梯度(10-1～10-7)，并對后3～4個梯度進行活菌數(shù)的測定，每個梯度平行3次。

1.6.5 測定酸乳穩(wěn)定性

參考劉素純等[8]關(guān)于測定酸乳離心沉淀率的方法來判斷酸乳的穩(wěn)定性。酸乳通過3 min的離心操作(8 000 r/min)后，移除上清液，酸乳的穩(wěn)定性即為沉淀物質(zhì)量與樣品質(zhì)量的比值如公式(1)所示：

(1)

1.6.6 測定酸乳蛋白水解酶活性

將1%(質(zhì)量分數(shù))的脫脂奶粉加入平板計數(shù)瓊脂中，在7 ℃條件下培養(yǎng)10 d后，進而在37 ℃下孵育48 h，形成透明成暈的菌落的蛋白水解酶活性記為陽性。

1.6.7 干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)的分析

參照雷文平等[9]測定發(fā)酵椰奶風味物質(zhì)的方法以氣質(zhì)聯(lián)用分析發(fā)酵乳揮發(fā)性風味物質(zhì)成分。將已滅菌好的脫脂乳分成等量的2份，一份加入3%(質(zhì)量分數(shù))的普通酸奶發(fā)酵劑，另一份加入1.5%(質(zhì)量分數(shù))的普通酸奶發(fā)酵劑和1.5%(質(zhì)量分數(shù))的干酪乳桿菌LC-7混合發(fā)酵。24 h后取出，分別放入氣質(zhì)聯(lián)用儀測定其揮發(fā)性風味物質(zhì)成分。

樣品預處理:在15 mL萃取瓶內(nèi)稱取1 g發(fā)酵好的酸乳樣品，將提取瓶的蓋子擰緊，并在50 ℃下處理30 min。老化后，萃取頭在70 ℃下吸附45 min。然后用氣質(zhì)聯(lián)用儀進樣口解吸1 min。

氣相色譜條件:DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);入口溫度為250 ℃;柱箱升溫程序:初始溫度35 ℃、3 min, 3 ℃/min升溫至200 ℃，20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min。載氣為氦氣，流速為1 mL/min。通過分流比10∶1的自動注射分流進行。

MS條件:電磁電離源，離子源溫度250 ℃；界面溫度200 ℃；檢測電壓1 kV，質(zhì)量掃描范圍m/z為35～400。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌LC-7的溫度生長曲線

繪制L.caseiLC-7 的生長曲線，橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為發(fā)酵液OD600nm值。結(jié)果如圖1所示，在42 ℃條件下，菌株生長規(guī)律不明顯，在32、34、37、40 ℃時菌株的生長趨勢相似，菌體濃度0～3 h生長遲緩，此時菌株進入生長的延滯期，此時菌株處于進入新環(huán)境后的適應(yīng)階段；菌體濃度在3～20 h進入對數(shù)生長期，進行快速生長繁殖；菌液濃度在20～24 h進入穩(wěn)定期，并緩慢上升，培養(yǎng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)積累達到最高峰，24 h后菌液濃度保持穩(wěn)定，即將進入衰亡期。在這4組溫度間，菌株在34 ℃的生長狀況優(yōu)于其他4組。在生長速度最快的8 h，發(fā)酵液的OD600nm值分別為0.476(34 ℃)、0.451(37 ℃)、0.373(42 ℃)；在24 h菌株達到穩(wěn)定期間，發(fā)酵液的OD600nm值為0.802(32 ℃)、0.813(34 ℃)、0.713(37 ℃)、40 ℃和42 ℃的OD600nm值還不到0.500。34 ℃時，菌株生長速度相對于比其他溫度快，34 ℃細菌生長延滯期短、指數(shù)期較快，穩(wěn)定后的菌液濃度也高于其他溫度。因此，可以確定該株菌的最適生長溫度為34 ℃。

圖1 不同溫度下L. casei LC-7 發(fā)酵液OD600nm值的變化Fig.1 Changes of OD600nm value of L. casei LC-7 fermentation broth at different temperatures

2.2 干酪乳桿菌LC-7的耐鹽性曲線

較高的鹽濃度會使微生物的滲透壓升高，水分活度降低，結(jié)果微生物的血漿壁分離死亡，因此益生菌的主要特征之一是耐鹽性。由圖2可知，菌株對鹽濃度較為敏感。NaCl質(zhì)量分數(shù)<3%時，對L.caseiLC-7 的生長影響可以忽略不記，當NaCl質(zhì)量分數(shù)達到7%時，LC-7的生長速度受到很大影響。

圖2 不同質(zhì)量分數(shù)NaCl對干酪乳桿菌LC-7生長的影響Fig.2 Effects of different NaCl concentrations on the growth of L. casei LC-7

2.3 干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵特性的測定

2.3.1L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過程中pH值的變化

發(fā)酵過程中，菌體代謝將乳糖轉(zhuǎn)化為乳酸，使牛乳變酸，pH值下降，同時與牛乳中的凝乳酶的共同作用，使牛奶凝固，并產(chǎn)生特定的風味，也可防止雜菌污染[10]。如圖3所示，對脫脂乳中發(fā)酵的干酪乳桿菌LC-7的酸度變化進行了測定。在發(fā)酵過程中pH值緩慢下降，14 h時肉眼可見酸乳逐漸變?yōu)榘牍腆w，開始凝乳轉(zhuǎn)變?yōu)槿樗幔?4 h時pH值達到了4.67。而酸乳在貯存期間pH值變化幅度較小，基本趨于穩(wěn)定。因此，干酪乳桿菌LC-7具有良好的乳品發(fā)酵性能。

圖3 L. casei LC-7 pH值隨發(fā)酵時間與貯藏時間的變化Fig.3 L. casei LC-7 pH value changes with fermentation time and storage time

2.3.2L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過程中滴定酸度的變化

菌體發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果控制著滴定酸度的變化。測定干酪乳桿菌LC-7在脫脂乳中發(fā)酵的酸度，以此評價菌種產(chǎn)酸作用強度。圖4顯示了隨著發(fā)酵時間的延長滴定酸度逐漸升高，滴定的酸度為40.4 °T。滴定酸度變化不明顯是在酸乳貯藏期間，一般保持在80～110 °T。由此可以確定其發(fā)酵酸乳具備產(chǎn)酸能力。

圖4 L. casei LC-7滴定酸度隨發(fā)酵時間與貯藏時間的變化Fig.4 Changes of L.casei titrated acidity with fermentation time and storage time

2.3.3L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過程中黏度的變化

黏度是評價酸奶口感及質(zhì)量控制的重要指標之一，若控制不好，會產(chǎn)生乳清析出，或出現(xiàn)豆腐樣結(jié)構(gòu)，影響其商業(yè)價值和食品安全[11]。由圖5可知，發(fā)酵開始時0～14 h發(fā)酵乳黏度變化較慢，增長幅度較小。14 h時開始發(fā)酵乳黏度增加；在20 h之后，發(fā)酵乳黏度增長迅速。這時發(fā)酵結(jié)束的酸奶中蛋白酶繼續(xù)發(fā)揮作用，催化底物蛋白水解，改變酸奶中微小蛋白質(zhì)亞膠體分子團的狀態(tài)，使得他們之間的親合作用減弱，進而引起酸奶膠體的剛性降低和膠體分子團聚集成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散的結(jié)果[12]，在酸乳貯藏時期，前期隨著時間延長，酸奶的黏度總體呈先上升，后期略微下降的趨勢，攪拌和均質(zhì)酸奶結(jié)構(gòu)遭到破壞，可能導致酸奶在貯藏期間黏度不穩(wěn)定，有部分乳清析出。

圖5 L. casei LC-7黏度隨發(fā)酵時間與貯藏時間的變化Fig.5 The L.casei viscosity changes with fermentation time and storage time

2.3.4L.caseiLC-7 酸奶在發(fā)酵以及貯藏過程中活菌數(shù)的變化

圖6為發(fā)酵過程中活菌的變化。前期活菌變化較小，發(fā)酵14 h后活菌變化增大。干酪乳桿菌LC-7的活菌數(shù)在整個發(fā)酵過程中呈上升趨勢，且呈正相關(guān)。發(fā)酵后，活菌總數(shù)達到6.2×107CFU/g。貯藏前期活菌數(shù)下降趨勢不明顯，后期下降趨勢明顯增加。24 d后的活菌數(shù)為4.3×107CFU/g。

圖6 L. casei LC-7活菌數(shù)隨發(fā)酵時間與貯藏時間的變化Fig.6 The number of L.casei viable bacteria changes with fermentation time and storage period

2.3.5L.caseiLC-7 酸乳在發(fā)酵以及貯藏過程中的穩(wěn)定性

由圖7可知，發(fā)酵酸乳的穩(wěn)定性在0～14 h呈緩慢上升趨勢，且穩(wěn)定性較高，14 h過后，酸奶開始凝乳，在發(fā)酵中后期，酸乳穩(wěn)定性急劇下降，但在貯藏階段，酸乳的穩(wěn)定性基本保持在55%～65%。這是由于酸奶在發(fā)酵期間酸度升高，而在貯藏期間酸度逐漸降低, 當達到酪蛋白的等電點時，酪蛋白膠粒會聚集沉降[13]，這兩方面會引起酸乳中微小蛋白質(zhì)的膠體分子團發(fā)生變化，使它們之間的親合作用減弱，使酸乳膠體的剛性降低和膠體分子團聚集成的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)松散，導致酸乳的穩(wěn)定性下降[14]。

圖7 L. casei LC-7酸乳穩(wěn)定性隨發(fā)酵時間與貯藏時間的變化Fig.7 The stability of yoghurt L.casei changed with fermentation time and storage time

2.3.6L.caseiLC-7 酸乳在發(fā)酵以及貯藏過程中的蛋白水解酶活性

因為蛋白質(zhì)被乳酸菌利用的能力差異較大，由于細胞內(nèi)蛋白酶的活性不同，所以有的蛋白質(zhì)被分解，還有一些只能利用胨、肽和氨基酸。在酸奶加工中，蛋白質(zhì)水解酶發(fā)揮重要作用。包括乳蛋白酶能釋放不同的肽和游離氨基酸，進而影響酸奶的物理結(jié)構(gòu)，同時會釋放功能肽，影響酸奶的風味[15]。

由表1可知，發(fā)酵酸乳在0～18 h均未出現(xiàn)透明圈，蛋白水解酶活性為陰性，20 h以后，在脫脂牛乳平板上出現(xiàn)透明圈，24 h透明圈較為明顯。蛋白水解酶活性為陽性。干酪乳桿菌LC-7具有水解蛋白的能力，但其水解活力較弱，再利用其發(fā)酵性質(zhì)時較為緩慢，但對于其風味的產(chǎn)生有益。

表1 L. casei LC-7發(fā)酵酸乳蛋白水解酶活性檢測結(jié)果Table 1 Results of proteolytic enzyme activity in L. casei LC-7 fermentation yoghurt

2.3.7L.caseiLC-7酸乳揮發(fā)性風味物質(zhì)分析

風味物質(zhì)中主要成分包括非揮發(fā)性酸、揮發(fā)性酸、羰基化合物及揮發(fā)性酯類等。而發(fā)酵乳風味的主要來源離不開其中的揮發(fā)酸和羰基化合物。產(chǎn)品的優(yōu)良性質(zhì)與這些風味物質(zhì)的含量有著密切關(guān)系[16]。由表2可知，干酪乳桿菌LC-7發(fā)酵酸乳的風味物質(zhì)占比較大，其中含有6種醇類、6種酸類、6種酯類、1種酚類和2種酮類物質(zhì)。

酸類物質(zhì)決定發(fā)酵酸乳的滋味，對比普通發(fā)酵酸乳與混合發(fā)酵酸乳中酸物質(zhì)的相對含量，發(fā)現(xiàn)車葉草苷酸和3-丁炔酸只在混合發(fā)酵酸乳中檢測到；苯甲酸與乙烯基癸酸在二者中均存在且相對含量較高，可見以上4類物質(zhì)是影響發(fā)酵酸乳的重要風味成分。

酮類物質(zhì)存在于混合發(fā)酵酸乳中，是酸乳中的重要風味物質(zhì)之一。其中2,3-二氫-3,5二羥基-6-甲基-4(H)-吡喃-4-酮和3-甲基-3-吡唑啉-5-酮的相對含量分別為為1.08%和0.186%。酮類揮發(fā)性化合物一般呈奶油味或果香味[17]，相比于普通發(fā)酵酸乳，其風味更加醇和。

酯類物質(zhì)也是酸乳中重要的風味物質(zhì)，普通發(fā)酵酸乳和混合發(fā)酵酸乳酯類含量都比較高，棕櫚酸乙烯酯、十八酸乙烯酯和甘油三酯在混合發(fā)酵乳中的相對含量最高，分別達到19.364%、32.835%和35.975%，但相比于普通發(fā)酵酸乳，酯類含量明顯降低，減少了酸乳的油膩感，使酸乳的口感更加清淡綿柔。

通過實驗可以看出，普通發(fā)酵劑發(fā)酵出的酸乳風味成分較為單一，相比于普通酸奶而言，干酪乳桿菌LC-7的揮發(fā)性風味物質(zhì)更豐富，尤其是在酸類和酮類物質(zhì)中較為明顯。且比普通酸乳多了酸味和果香味，使酸乳的口味更佳。

3 結(jié)論

作為益生菌之一的干酪乳桿菌，不僅對人體無任何毒害作用，而且還可以對其宿主營養(yǎng)、免疫、防病等具有顯著的益生功效[12]。本實驗對現(xiàn)有保藏的1株經(jīng)驗證后具有潛在益生特性的干酪乳桿菌LC-7的最適生長條件和發(fā)酵特性進行研究，綜上實驗可以得出，干酪乳桿菌LC-7的最適生長溫度為34 ℃，且在人體一定鹽濃度環(huán)境下可以存活，具備較好的耐鹽性能；34 ℃條件下24 h基本進入穩(wěn)定生長期。其發(fā)酵性能良好，14 h基本凝乳，發(fā)酵結(jié)束時pH值為4.67，滴定酸度為86.6 °T，黏度基本維持在189 mPa·s。4 ℃貯藏時其穩(wěn)定性基本保持在55%～65%。揮發(fā)性風味物質(zhì)優(yōu)于普通發(fā)酵酸乳?？傊? 本試驗為干酪乳桿菌在今后開發(fā)利用上提供了重要理論研究，但對于其確切的功能性質(zhì)以及制作乳制品發(fā)酵劑還需要動物模型實驗進行進一步的驗證，后續(xù)工作仍有待考究。

表2 不同樣品揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components of different samples