張愛寧，張藝，季燁龍，熊永紅，冷燕，夏中元

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院麻醉科，武漢 430060)

由于地球的自轉(zhuǎn)及公轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，生物環(huán)境在24 h的周期循環(huán)中不斷變化。地球上的生命基于環(huán)境演化出適合日常生存的分子鐘。生物體內(nèi)的基因表達(dá)受24 h周期的調(diào)控，即生物體基因的表達(dá)具有節(jié)律性，大多數(shù)生物體普遍存在的一個(gè)晝夜節(jié)律行為即進(jìn)食/禁食周期，它影響機(jī)體的新陳代謝[1]。在哺乳動(dòng)物中，晝夜節(jié)律會(huì)影響各種生理行為(睡眠-覺醒周期、內(nèi)分泌系統(tǒng)、體溫、運(yùn)動(dòng)活動(dòng)等)，其本質(zhì)受機(jī)體內(nèi)生物鐘的驅(qū)動(dòng)[2]。若晝夜節(jié)律被打亂，機(jī)體將會(huì)發(fā)生一系列病理生理的改變。有學(xué)者利用化學(xué)誘變的方法，在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種可調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的基因，并將其命名為Period (Per)基因[3]。Per基因家族是調(diào)控晝夜節(jié)律生物鐘的核心組分之一，哺乳動(dòng)物有3個(gè)Per同源基因，即Per1、Per2和Per3，在調(diào)節(jié)體內(nèi)晝夜節(jié)律變化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。Per基因家族的3個(gè)成員在心血管系統(tǒng)不同成分中的表達(dá)略有差異，發(fā)揮的生理作用也有所不同，三者通過各自的作用機(jī)制協(xié)調(diào)合作，共同實(shí)現(xiàn)心血管系統(tǒng)晝夜節(jié)律的穩(wěn)定。已有研究證實(shí)，Per基因及其晝夜節(jié)律與許多心血管疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，包括心肌梗死、心肌梗死后的缺血再灌注損傷和心力衰竭等[4]?，F(xiàn)就時(shí)鐘基因Per的晝夜節(jié)律與心血管疾病關(guān)系的研究進(jìn)展予以綜述。

1 Per基因與生物晝夜節(jié)律的基礎(chǔ)研究

1.1Per基因的生物學(xué)特點(diǎn)與晝夜節(jié)律 晝夜節(jié)律最早被科學(xué)家們用來描述改變果蠅飛行行為節(jié)律的24 h內(nèi)源振蕩，而Per基因是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的控制晝夜節(jié)律的遺傳成分。1984年，有學(xué)者首次測(cè)出了Per基因附近的基因組DNA序列，這段DNA可轉(zhuǎn)錄出長(zhǎng)度分別為0.9 kb和4.5 kb的兩種信使RNA，且長(zhǎng)度為4.5 kb的信使RNA在胞內(nèi)的濃度波動(dòng)符合晝夜變化規(guī)律，其對(duì)應(yīng)的DNA序列即為Per基因[5]。

Per基因作為調(diào)控晝夜節(jié)律的關(guān)鍵基因，與其他時(shí)鐘基因[Bmal1 (brain and muscle aryl-hydrocarbon receptor nuclear translocator-like 1)、Clock (circadian locomotor output cycles kaput)和Cry (cryptochrome)等]共同形成可精確控制生物節(jié)律的一系列與轉(zhuǎn)錄/翻譯相關(guān)的正負(fù)反饋環(huán)路，而Per基因是該振蕩環(huán)路關(guān)鍵的負(fù)性調(diào)控元件。在生物節(jié)律的主要反饋回路中，兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Bmal1和Clock與Per基因啟動(dòng)子區(qū)的E-box元件相互作用，激活Per基因在細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄信使RNA，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后則受正反饋調(diào)節(jié)，不斷翻譯產(chǎn)生目的蛋白，即Per1、Per2和Per3蛋白[6]。當(dāng)Per蛋白在胞質(zhì)中逐漸聚集達(dá)到一定濃度后，會(huì)與另一時(shí)鐘基因Timeless的翻譯產(chǎn)物Tim蛋白發(fā)生相互作用，使Per蛋白可被胞質(zhì)中的酪蛋白激酶1ε磷酸化，隨后穿梭至胞核，與含有E-box序列的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)揮其負(fù)性調(diào)控作用，抑制Per基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)和控制機(jī)體的晝夜節(jié)律[7]。

在通路的負(fù)反饋循環(huán)中，一個(gè)關(guān)鍵的特征為抑制復(fù)合物Per-Tim蛋白在夜間的緩慢積累，該抑制復(fù)合物在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的濃度逐漸升高，達(dá)到峰值后又開始降低，且升高與降低兩個(gè)階段在時(shí)間上同步于24 h周期中細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄的活躍和不活躍階段[8]。這就要求細(xì)胞質(zhì)中Per-Tim信使RNA根據(jù)時(shí)間節(jié)律維持和調(diào)節(jié)自身的穩(wěn)定性。POP2(pyrin-only protein 2)是一種腺苷酸酶，是腺苷酸化復(fù)合體CCR4-NOT(carbon catabolite repression 4-negative on TATA-less)的一個(gè)亞基，可縮短信使RNA的多聚腺苷酸(A)尾的長(zhǎng)度，當(dāng)胞質(zhì)中的POP2濃度降低時(shí)，Tim信使RNA的多聚腺苷酸化增強(qiáng)，使得多聚腺苷酸(A)尾長(zhǎng)度增加，維持Tim信使RNA的穩(wěn)定性；POP2并不控制Per信使RNA的穩(wěn)定性，反之，Per基因通過某種間接機(jī)制抑制POP2依賴性的Tim信使RNA腺苷酸化[9]。

1.2Per基因在心血管系統(tǒng)中的表達(dá) 哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律系統(tǒng)由分層的多振蕩器結(jié)構(gòu)組成，主要包括中樞起搏器(中央時(shí)鐘)和外周振蕩器(外圍時(shí)鐘)，兩者通過神經(jīng)-體液網(wǎng)絡(luò)相互連接。中央時(shí)鐘位于下丘腦的視交叉上核(suprachiasmatic nucleus，SCN)，同步化整個(gè)人體的外圍時(shí)鐘，而外圍時(shí)鐘在受到中央時(shí)鐘調(diào)控的同時(shí)，也可獨(dú)立調(diào)節(jié)機(jī)體組織器官的節(jié)律活動(dòng)[10]。已有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SCN損傷的小鼠外周器官中仍具有恒定水平的時(shí)鐘基因表達(dá)[11]。Per基因家族在中央、心臟及血管外圍時(shí)鐘中均有表達(dá)，且Per1的表達(dá)具有高度的心肌特異性，它與心肌細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)關(guān)鍵因子——鈣轉(zhuǎn)運(yùn)ATP酶的晝夜節(jié)律等密切相關(guān)[1]。Per2可在心肌和血管內(nèi)皮等細(xì)胞中表達(dá)，參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮依賴性血管舒張等，同時(shí)參與內(nèi)源性心肌缺血的保護(hù)機(jī)制[2]。Per3在靈長(zhǎng)類，包括在人類中的表達(dá)均具有串聯(lián)重復(fù)序列(variable number tandem repeat，VNTR)多態(tài)性，這種多態(tài)性會(huì)影響包括心臟在內(nèi)的不同組織中各種基因的晝夜節(jié)律表達(dá)，有助于心臟功能的調(diào)節(jié)[12]。Per基因家族與其他時(shí)鐘基因共同作用于心臟和血管，以維持血壓、心率、心肌細(xì)胞電活動(dòng)以及機(jī)械活動(dòng)的晝夜節(jié)律性波動(dòng)。

2 Per基因調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的作用機(jī)制

與其他外周組織相比，心血管系統(tǒng)中核心時(shí)鐘基因的表達(dá)更為豐富。由于Per1、Per2和Per3在心臟和血管中的表達(dá)水平不同，三者既通過各自不同的機(jī)制參與心血管系統(tǒng)的生理活動(dòng)，同時(shí)又相互協(xié)調(diào)，與其他時(shí)鐘基因共同維持心血管系統(tǒng)的晝夜節(jié)律。

時(shí)鐘基因 Per1參與細(xì)胞鈣循環(huán)的調(diào)節(jié)，但具體機(jī)制目前尚未明確。鈣循環(huán)是指細(xì)胞內(nèi)鈣離子(Ca2+)不斷地釋放和再攝取，這一過程驅(qū)動(dòng)心肌收縮和舒張。肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶(sarcoendoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCA)是維持細(xì)胞內(nèi)鈣循環(huán)的關(guān)鍵因子，主要在興奮-收縮偶聯(lián)過程中負(fù)責(zé)Ca2+的再攝取[13]，SERCA2a是SERCA在心臟中表達(dá)的亞型。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Per1濃度達(dá)到晝夜高峰時(shí)，SERCA2a的活性達(dá)到晝夜最低值，心肌的收縮和舒張活動(dòng)減弱；同時(shí)，Per1對(duì)腎臟鈉的重吸收具有調(diào)節(jié)作用，間接調(diào)節(jié)機(jī)體血壓的晝夜變化[14]。Richards等[15]的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，Per1參與腎小管上皮細(xì)胞鈉離子通道(epithelial sodium channel，ENaC)α亞基的基礎(chǔ)調(diào)節(jié)以及醛固酮誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)。ENaC是腎集合管鈉重吸收的重要調(diào)節(jié)因子，負(fù)責(zé)鈉重吸收的微調(diào)，進(jìn)而有助于控制血容量，起到調(diào)節(jié)血壓的作用，當(dāng)Per1基因被敲除或表達(dá)受到抑制時(shí)，ENaC的活性顯著降低，鈉的重吸收減少，血壓降低[16]。除ENaC外，Per1還協(xié)同調(diào)節(jié)了其他參與鈉重吸收的多個(gè)基因的表達(dá)[17]。

時(shí)鐘基因Per2是調(diào)節(jié)血壓和心率晝夜節(jié)律變化的關(guān)鍵組成部分，參與維持血管正常的舒縮功能。Per2基因突變的小鼠表現(xiàn)出血壓降低、心率加快的趨勢(shì)[18]。研究證實(shí)，小鼠Per2基因突變可導(dǎo)致主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙，包括一氧化氮生成減少、血管舒張性前列腺素減少以及由環(huán)加氧酶1衍生的血管收縮劑釋放增加[19]，表明Per2可能在調(diào)節(jié)血管功能中發(fā)揮作用。此外，Per2基因還通過直接且特異性地抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ來調(diào)節(jié)白色脂肪組織中的正常脂質(zhì)代謝，Per2基因突變會(huì)導(dǎo)致脂質(zhì)分解顯著減弱，動(dòng)脈內(nèi)脂質(zhì)加速沉積[20]。同時(shí)，另一項(xiàng)研究證實(shí)，Per2基因具有調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子1α的作用，可促進(jìn)心肌細(xì)胞進(jìn)行高效糖酵解，作為腺苷受體亞型A2b的靶基因，Per2在A2b的調(diào)控下控制依賴于缺氧誘導(dǎo)因子1α的心臟代謝和局部缺血耐受[21]。因此，Per2似乎在心臟缺血適應(yīng)的調(diào)節(jié)中起著不可或缺的作用，也可能參與血管功能和代謝的調(diào)節(jié)。

時(shí)鐘基因Per3在心臟中的表達(dá)與心臟活動(dòng)的晝夜節(jié)律同步，其基因表達(dá)水平與心臟的日常適應(yīng)相關(guān)，若心肌細(xì)胞為適應(yīng)持續(xù)的壓力超負(fù)荷而發(fā)生肥大，Per3基因的表達(dá)也將受到影響[22]。另外，在血管平滑肌內(nèi)也可找到Per3基因。研究人員已發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的人頸動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞和在體人頸動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞均具有時(shí)鐘基因Per3、Bmal1等的節(jié)律性振蕩，它們對(duì)血管壁的結(jié)構(gòu)和功能起重要作用，參與動(dòng)脈粥樣硬化和斑塊破裂的發(fā)病機(jī)制[23]。另外，Per3基因可調(diào)節(jié)血管壁固有成分的含量，從而改變血管壁剛度，維持血管順應(yīng)性[24]。Per3 VNTR可影響睡眠穩(wěn)態(tài)和個(gè)體間的睡眠偏好，而睡眠周期影響心臟的自主調(diào)節(jié)，特別是交感迷走神經(jīng)的平衡，其機(jī)制之一為Per3基因通過對(duì)白細(xì)胞介素-6、B型腦鈉肽和維生素A等物質(zhì)的濃度調(diào)節(jié)，調(diào)整血壓和心率的變化，參與心血管代謝活動(dòng)[25]。

3 Per基因與心血管系統(tǒng)疾病

心血管系統(tǒng)的許多生理活動(dòng)會(huì)在一天內(nèi)隨時(shí)間發(fā)生規(guī)律的波動(dòng)，表現(xiàn)出驚人的晝夜時(shí)間依賴性震蕩，以維持正常的生理功能。事實(shí)上，在心臟和血管中，約10%的基因轉(zhuǎn)錄和約10%的蛋白質(zhì)翻譯受到晝夜節(jié)律的調(diào)控[26]。晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致心臟病風(fēng)險(xiǎn)增加和不良心血管事件的發(fā)生，不利于疾病的轉(zhuǎn)歸。機(jī)體可由于血壓、心率、心排血量、外周血管阻力、血管舒張激素活性或血小板反應(yīng)性等方面的晝夜變化而引發(fā)不良心血管事件，其中心肌缺血、心肌梗死、心源性猝死或室性心律失常等常發(fā)生于清晨[27]。心肌梗死期間的疼痛發(fā)作具有晝夜變化規(guī)律，發(fā)病率在清晨增加，在晚上出現(xiàn)第二個(gè)小高峰[28]。Per基因作為晝夜節(jié)律振蕩回路中的核心環(huán)節(jié)，以多種機(jī)制在心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮作用。

3.1Per基因與高血壓 原發(fā)性高血壓是多種心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。一天中，正常機(jī)體的血壓會(huì)在一定范圍內(nèi)發(fā)生波動(dòng)，通常在清晨6～8點(diǎn)達(dá)到高峰，而在夜間1～2點(diǎn)熟睡狀態(tài)下降至全天最低值。晝夜節(jié)律的中斷或紊亂會(huì)影響血壓的正常調(diào)節(jié)，永久性夜班的工人在血壓和心率升高的同時(shí)，心率變異性會(huì)有所降低，其收縮壓和舒張壓升高后，血壓恢復(fù)的時(shí)間較正常情況有延遲[29]。Per基因在控制血壓方面起著重要作用，但其作用機(jī)制目前尚未完全清楚，而原發(fā)性高血壓又可影響Per基因的表達(dá)，改變其轉(zhuǎn)錄與翻譯的節(jié)律。一項(xiàng)研究顯示，與正常血壓對(duì)照者相比，高血壓患者腎臟髓質(zhì)中Per1信使RNA的濃度顯著增加[30]。Tanaka等[31]通過收集原發(fā)性高血壓大鼠在12 h明暗周期下每隔4小時(shí)的腎上腺及血清樣品，并從中提取信使RNA分析時(shí)鐘基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，Per2、Per3、Bmal1等時(shí)鐘基因在腎上腺中的表達(dá)相位較對(duì)照大鼠均有所提前。與野生型小鼠相比，給予高鹽飲食和長(zhǎng)效醛固酮類似物去氧皮質(zhì)酮戊酯Per1基因敲除的雄性小鼠在發(fā)生原發(fā)性高血壓風(fēng)險(xiǎn)降低的同時(shí)，會(huì)出現(xiàn)顯著的血壓節(jié)律紊亂[32]，而雌性小鼠可免受血壓調(diào)控失常，部分原因可能由于卵巢雌激素對(duì)心血管產(chǎn)生的保護(hù)作用[33]。以上研究均表明，Per基因具有調(diào)節(jié)血壓、維持血壓正常節(jié)律的作用，且Per基因的突變與原發(fā)性高血壓有密切關(guān)系。

3.3Per基因與心力衰竭 由缺血性心臟病繼發(fā)的心力衰竭是全球人口發(fā)病率和病死率的主要原因，而缺血性心臟病的發(fā)作具有顯著的晝夜節(jié)律性。Montaigne等[43]的隨機(jī)研究結(jié)果顯示，在行主動(dòng)脈瓣置換術(shù)的患者中，手術(shù)時(shí)間為下午組的圍手術(shù)期主要不良心臟事件發(fā)生率低于清晨組，而午后患者的相對(duì)危險(xiǎn)性降低是由圍手術(shù)期心肌梗死和急性心力衰竭發(fā)生率降低所致。這意味著心力衰竭的發(fā)生具有時(shí)間節(jié)律依賴性。此外，已有實(shí)驗(yàn)證明，晝夜節(jié)律變化有助于缺血性心臟病和心力衰竭的心肌重構(gòu)[33]。如正常24 h生理周期的C57BL/6小鼠，若改變其光暗輪換周期，所產(chǎn)生的壓力超負(fù)荷誘導(dǎo)的心肌肥大較在正常24 h光暗周期下的小鼠更嚴(yán)重，證明中央時(shí)鐘與外圍時(shí)鐘調(diào)控節(jié)律的不同步會(huì)加劇心臟重構(gòu)，并可迅速進(jìn)展為心力衰竭[44]。急性心肌梗死發(fā)生時(shí)，缺血區(qū)域時(shí)鐘基因的振蕩幅度衰減，且缺血與非缺血區(qū)域生物鐘節(jié)律的不同步性，加劇心肌梗死的惡化和心力衰竭的發(fā)生[45]。這些研究提示，時(shí)鐘基因表達(dá)異常可能是調(diào)控心肌缺血再灌注損傷的重要病理生理機(jī)制。心力衰竭的特征之一是SERCA2a表達(dá)水平和活性降低引起的肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+攝取受損，SERCA2a功能障礙所致的鈣循環(huán)紊亂是心肌缺血再灌注損傷加重的關(guān)鍵[46]。研究發(fā)現(xiàn)，p38促分裂原活化的蛋白激酶磷酸化是經(jīng)受磷蛋白途徑活化SERCA2a的關(guān)鍵，而p38促分裂原活化的蛋白激酶具有晝夜節(jié)律性，且由 Per1直接調(diào)控[47]。這些證據(jù)表明，Per1基因參與了缺血再灌注損傷和心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展。鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑對(duì)全因性心力衰竭有顯著的治療作用，而鹽皮質(zhì)激素受體可介導(dǎo)心臟炎癥和纖維化，心肌細(xì)胞鹽皮質(zhì)激素受體選擇性缺失可導(dǎo)致心臟中的Per2基因失調(diào)；缺乏外周組織正常晝夜節(jié)律時(shí)鐘振蕩的小鼠對(duì)脫氧鹽皮質(zhì)激素的特征性心臟炎癥/纖維化反應(yīng)顯著減弱；同時(shí)，H9c2心肌細(xì)胞時(shí)鐘基因表達(dá)的增加增強(qiáng)了鹽皮質(zhì)激素受體介導(dǎo)的Per1基因的反式激活，提示轉(zhuǎn)錄因子在心臟炎癥/纖維化和心力衰竭的發(fā)展過程起協(xié)同作用[48]。

3.4Per基因與動(dòng)脈粥樣硬化 動(dòng)脈粥樣硬化的好發(fā)人群主要為老年人，幾乎每個(gè)老年人均有不同程度的動(dòng)脈硬化。近年來，隨著人們生活質(zhì)量的不斷改善，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病逐漸呈年輕化趨勢(shì)，其病變的基礎(chǔ)為脂質(zhì)代謝障礙。研究人員將敲除Per1、Per2基因小鼠的主動(dòng)脈移植到野生型小鼠體內(nèi)，野生型小鼠發(fā)展為頑固性動(dòng)脈硬化疾病，證明了時(shí)鐘基因在動(dòng)脈硬化性疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭凶鳛樽灾饔绊懙闹匾訹49]。Per2基因突變的小鼠，由于一氧化氮生成減少及環(huán)加氧酶1衍生的血管收縮劑釋放增加表現(xiàn)出主動(dòng)脈內(nèi)皮功能障礙，增加了促炎因子的表達(dá)，推動(dòng)了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[50-51]。另有研究顯示，從動(dòng)脈粥樣硬化病變中分離出的血管平滑肌細(xì)胞中的Per2基因表達(dá)維持在相對(duì)恒定的水平，晝夜振蕩受到破壞[52]。脈搏波速度的增加是動(dòng)脈僵硬的一個(gè)指標(biāo)，Asmar等[53]通過評(píng)估血流速度波形沿動(dòng)脈段的傳輸時(shí)間，發(fā)現(xiàn)Per基因敲除的小鼠主動(dòng)脈的脈搏波速度增加；進(jìn)一步通過計(jì)算測(cè)得Per基因敲除小鼠的血管壁厚度及剛度增加，血管順應(yīng)性降低，說明Per基因在維持血管順應(yīng)性、阻遏動(dòng)脈硬化方面具有正向作用。高膽固醇血癥是發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素之一，高膽固醇血癥和晝夜節(jié)律異常的結(jié)合可能影響心血管疾病的進(jìn)展。Akashi等[54]通過向Per2基因引入突變，產(chǎn)生了晝夜節(jié)律受損的低密度脂蛋白受體缺陷小鼠，而在小鼠發(fā)生高膽固醇血癥的同時(shí)，其動(dòng)脈斑塊面積也顯著增大，這意味著Per晝夜節(jié)律紊亂加速了動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展。

4 小 結(jié)

晝夜節(jié)律紊亂可破壞心血管系統(tǒng)的正常生理功能。Per基因通過各種復(fù)雜的分子機(jī)制調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)的活動(dòng)，參與多種心血管疾病的病理生理過程。對(duì)Per基因及其調(diào)節(jié)因子進(jìn)行靶向治療，為心血管疾病的治療提供了新思路和研究方向。已有研究者發(fā)現(xiàn)，可通過強(qiáng)光治療誘導(dǎo)Per2依賴性miR-21的表達(dá)上調(diào)，調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞缺氧和代謝途徑，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用，減小心肌梗死面積[55]。L-茶氨酸也被證實(shí)可增加Per2、Bmal1、Cry1等時(shí)鐘基因表達(dá)的晝夜振蕩幅度，在調(diào)節(jié)血管晝夜節(jié)律系統(tǒng)中起重要作用，從而預(yù)防代謝綜合征和心血管疾病[56]。隨著Per基因?qū)π难芟到y(tǒng)的影響機(jī)制不斷被闡明，Per基因有望成為治療心血管疾病的新靶點(diǎn)。