祝友朋，韓長志

西南林業(yè)大學生物多樣性保護學院/云南省森林災害預警與控制重點實驗室，昆明 650224

植物病原絲狀真菌在實現(xiàn)對植物侵染的過程中，為了更好地在植物中實現(xiàn)定殖和擴展等過程，會分泌大量的效應分子，包括分泌蛋白以及CAZymes蛋白等，與植物中的防衛(wèi)反應相關蛋白分子發(fā)生相互作用[1]。以往的研究發(fā)現(xiàn)，眾多細胞信號轉導途徑參與上述過程，其中鳥嘌呤核苷酸結合蛋白信號途徑所發(fā)揮的作用較大[2]，主要作用為將外界信號傳遞到細胞內。G蛋白信號調控因子(regulators of G-protein signaling，RGS)作為該途徑的負調控因子[2]，其主要功能是通過促進G蛋白α亞基(Gα)偶聯(lián)的GTP水解，促進Gα和Gβγ亞基的再聚合，導致G蛋白失活，使上述信號通路迅速關閉[3-4]。

研究發(fā)現(xiàn)眾多真菌中都含有RGS蛋白，如構巢曲霉Aspergillusnidulans有5個[5]，輪枝鐮刀菌Fusariumverticillioides有6個，釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeS288c有4個[6]，稻瘟病菌Magnaportheoryzae有8個，新型隱球菌Cryptococcusneoformans有3個，玉米赤霉菌Gibberellazeae有7個，禾谷炭疽菌Colletotrichumgraminicola有6個[7]，希金斯炭疽菌C.higginsianum有6個，引起橡膠炭疽病的膠孢炭疽菌RGS蛋白的數(shù)量有10個。另外，對膠孢炭疽菌RGS蛋白的生物學功能進行解析，發(fā)現(xiàn)RGS蛋白在膠孢炭疽菌的菌絲發(fā)育、產孢、次生代謝產物及色素合成，以及致病性和有性生殖調控等方面發(fā)揮著重要作用。同時，前人研究發(fā)現(xiàn)，相對于專性寄生性真菌而言，非專性寄生植物病原絲狀真菌編碼的分泌蛋白占基因組編碼基因的比例較高，在CAZymes家族中糖苷水解酶家族GH和多糖裂解酶家族PL所占比例也較高[8]。然而，上述研究更多關注的是某種真菌中RGS蛋白的數(shù)量和功能，以及植物病原絲狀真菌寄生性與CAZymes之間的關系，對于植物病原真菌寄生性與RGS蛋白之間關系的研究尚未見報道。本研究基于比較基因組學，對OrthoVenn2真菌數(shù)據(jù)庫中49個絲狀真菌開展全基因組同源基因對比分析，同時，利用SMART在線軟件對所獲得的蛋白序列開展保守結構域預測分析，以期明確49個真菌RGS蛋白的數(shù)量和類型，分析植物病原絲狀真菌寄生性與RGS蛋白之間的關系，旨在為今后進一步解析RGS蛋白在病原真菌的生長發(fā)育與致病過程中的功能研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 真菌及其基因組數(shù)據(jù)

選擇16個目共49個真菌開展研究，包括模式生物(構巢曲霉A.nidulans、釀酒酵母S.cerevisiae、粗糙脈孢霉Neurosporacrassa)；植物病原菌(活體營養(yǎng)型：玉米絲黑穗病菌Sporisoriumreilianum、玉米黑粉菌Ustilagomaydis、松楊柵銹菌Melampsoralaricipopulina、禾本科布氏白粉菌Blumeriagraminis、小麥稈銹病菌Pucciniagraminis、葉銹菌Pucciniatriticina、花藥黑粉菌Microbotryumviolaceum；半活體營養(yǎng)型：稻瘟菌M.oryzae、禾谷鐮刀菌Fusariumgraminearum、禾谷炭疽菌C.graminicola、小麥殼針孢葉枯病菌Zymoseptoriatritici、希金斯炭疽菌C.higginsianum、藤黑鐮刀菌Fusariumfujikuroi、西瓜炭疽菌Colletotrichumorbiculare、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides、小麥穎枯病菌Parastagonosporanodorum、圓核腔菌Pyrenophorateres、斑點小球腔菌Leptosphaeriamaculans、松穴褥盤孢菌Dothistromaseptosporum；死體營養(yǎng)型：核盤菌Sclerotiniasclerotiorum、灰霉菌Botrytiscinerea、大麗輪枝菌Verticilliumdahlia、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、假禾谷鐮刀菌Fusariumpseudograminearum、串珠鐮刀菌F.verticillioides、腐皮鐮刀菌Fusariumsolain、小麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis、草坪斑枯病菌Magnaporthepoae)；非致病菌(土曲霉Aspergillusterreus、棒曲霉Aspergillusclavatus、煙曲霉Aspergillusfumigatus、費氏曲霉Aspergillusfischeri、米曲霉Aspergillusoryzae、黃曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉Aspergillusniger、里氏木霉Trichodermareesei、綠木霉Trichodermavirens、畢赤酵母Komagataellapastoris、解脂耶氏酵母Yarrowialipolytica、棉阿舒囊霉Ashbyagossypii、日本裂殖酵母Schizosaccharomycesjaponicus、粟酒裂殖酵母Schizosaccharomycespombe、嗜冷裂殖酵母Schizosaccharomycescryophilus、八孢裂殖酵母Schizosaccharomycesoctosporus、銀耳Cryptococcusneoformans、松露Tubermelanosporum)。

1.2 真菌中RGS蛋白獲得

首先，通過文獻資料，收集前人關于S.cerevisiae、A.nidulans[5,9-11]、M.oryzae、C.graminicola[7]、C.higginsianum等報道的RGS蛋白登錄號，并利用OrthoVenn2[12]在線軟件(https://orthovenn2.bioinfotoolkits.net/task/create)對本研究中49個真菌開展全基因組直系同源基因簇對比分析；其次，利用真菌蛋白數(shù)據(jù)庫，根據(jù)S.cerevisiaeS288C的4個RGS蛋白[6,13]氨基酸序列在線BLASTp比對，所有參數(shù)均選擇默認值；同時，利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，輸入“菌名 Regulators of G-protein signaling”、“菌名 RGS”檢索RGS；再次，通過合并、去重，獲得其他真菌所含有的RGS蛋白序列；最后，利用SMART預測上述RGS蛋白序列的保守結構域，最終明確上述真菌中的RGS蛋白序列。

1.3 系統(tǒng)進化樹構建

對得到的RGS蛋白序列，用ClustalX進行多重比對分析，然后用MEGA 7.0.14軟件采用鄰近法構建系統(tǒng)進化樹，距離計算采用p-Distance模型，重復1 000次[14]。

2 結果與分析

2.1 不同寄生性絲狀真菌中RGS蛋白數(shù)量預測及對比分析

利用OrthoVenn2在線軟件對49個真菌中RGS蛋白同源基因簇進行對比，共獲得224條RGS蛋白相關序列，根據(jù)S.cerevisiaeS288C的RGS蛋白序列在線BLASTp比對，共發(fā)現(xiàn)238條序列，同時，利用NCBI數(shù)據(jù)庫，進行關鍵詞檢索，共發(fā)現(xiàn)314條序列，對上述所獲得的全部RGS蛋白序列進行合并、去重，并結合SMART保守結構域分析，最終得到229條含有RGS保守結構域的典型RGS蛋白序列。進一步對上述序列進行分析，明確不同真菌中所含有的RGS蛋白數(shù)量為3～9個，其中F.oxysporum中所含RGS蛋白最多，有9個，其次為C.graminicola，有8個；S.cerevisiae、U.maydis、P.graminis、A.niger、S.pombe等數(shù)量最少，都為3個。

按照模式生物、植物病原真菌及非致病菌3種類別進行RGS蛋白數(shù)量統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)植物病原真菌中存在的RGS蛋白數(shù)量較多(圖1A)。為了進一步明確植物病原真菌寄生性與RGS蛋白之間的關系，將植物病原菌按照活體營養(yǎng)型、半活體營養(yǎng)型、死體營養(yǎng)型等寄生性類型進行分類，結果發(fā)現(xiàn)，死體營養(yǎng)型病原菌中RGS蛋白數(shù)量最多，其次為半活體營養(yǎng)型病原菌、模式生物，活體營養(yǎng)型病原菌數(shù)量最少(圖1B)。

A. 模式生物、病原菌及非致病菌RGS數(shù)量對比。 B.不同營養(yǎng)類型病原菌RGS數(shù)量對比。A.Comparison of RGS quantities of model organisms,pathogenic fungi and non-pathogenic fungi; B.Comparison of RGS quantities of pathogens of different nutritional types.

2.2 不同寄生性真菌中RGS蛋白種類及對比分析

對229個RGS蛋白序列進行保守結構域預測分析，發(fā)現(xiàn)主要存在6種類型(圖2A)，其中有4種為大多數(shù)真菌所共有，分別為DEP-RGS、RGS-TM(跨膜區(qū))、PXA-RGS-PX、RGS，數(shù)量分別為58、56、46、44個；其他2種分別為RGS-PAS-PAC(17個)、TM-RGS(8個)(圖2B)。進一步分析，明確上述RGS蛋白均具有1個RGS保守結構域，其中DEP結構域用于膜靶向[15]，是1個約80個殘基組成的球形結構域，大多數(shù)的真菌RGS在氨基端包含2個DEP結構域，其主要功能是將含有DEP結構域的蛋白質靶向特定的亞細胞膜位點，在靶向G蛋白偶聯(lián)的信號傳導途徑中發(fā)揮選擇性作用；PX結構域，是一個約120個殘基組成的結構域，發(fā)揮著多種功能，如細胞信號傳導、水泡運輸、蛋白質分選和脂質修飾等，能夠與PXA結構域結合，作用于液泡形態(tài)分化和將蛋白定位在液泡；PAS結構域參與許多信號蛋白的傳遞，在其中被用作信號傳感器，PAC域出現(xiàn)在所有已知PAS域的C末端，有助于PAS結構域折疊。

進一步分析6種類型RGS蛋白在49個真菌中的存在情況，結果顯示，類型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的RGS蛋白存在于多數(shù)真菌中，類型Ⅴ和Ⅵ的RGS蛋白主要集中在半活體營養(yǎng)型病原菌和死體營養(yǎng)型病原菌中。具體而言：類型Ⅰ除S.sclerotiorum外，其他48個真菌中均存在；類型Ⅱ在49個真菌中都存在，類型Ⅲ除Z.tritici、S.cerevisiae、A.niger外，其他46個真菌中都存在；類型Ⅳ除V.dahlia、S.japonicus、S.pombe、S.cryophilus、S.octosporus、M.laricipopulina、P.graminis、P.triticina、S.reilianum、U.maydis、C.neoformans、M.violaceum外，其他37個真菌中都存在；類型Ⅴ在C.graminicola、F.solain、C.higginsianum、G.graminis、C.orbiculare、M.poae、C.gloeosporioides、M.oryzae、S.sclerotiorum、B.cinerea等10個真菌中存在；類型Ⅵ在A.fumigatus、A.fischeri、T.reesei、C.graminicola、V.dahlia、C.orbiculare、C.gloeosporioides、P.nodorum等8個真菌中存在，類型Ⅴ和Ⅵ的數(shù)量和種類都較少，且集中在植物病原菌中。

2.3 遺傳關系分析

對49個真菌的229條RGS蛋白序列進行遺傳關系分析，結果發(fā)現(xiàn)，229個序列聚為6類，該結果與通過保守結構域預測結果所分類別一致。其中類型Ⅰ、Ⅵ和Ⅲ親緣關系上較近，類型Ⅱ和Ⅳ在親緣關系上較近，Ⅴ類單獨為一支(圖3)。

A. 絲狀真菌中6種RGS的類別； B. 絲狀真菌中6種RGS的數(shù)量。A.Categories of 6 RGS in filamentous fungi; B.Number of 6 RGS in filamentous fungi.

圖3 不同真菌中RGS蛋白序列之間的遺傳關系

2.4 已報道真菌中RGS蛋白數(shù)量的差異分析

對已報道真菌的RGS蛋白數(shù)量與此次發(fā)現(xiàn)的RGS蛋白數(shù)量進行對比分析，發(fā)現(xiàn)存在著一定的差異，其中S.cerevisiae、A.nidulans、F.verticillioides和M.oryzae的RGS數(shù)量減少，C.graminicola、C.higginsianum和C.gloeosporioides的RGS蛋白增多(表1)。

表1 真菌中RGS蛋白數(shù)量與前人研究存在差異的具體情況 Table 1 Compare with the number of RGS protein between this study and previous studies in different fungi

3 討 論

以49個全基因組序列已經釋放的真菌為研究對象，通過OrthoVenn2同源基因簇比對、BLASTp比對和關鍵詞搜索3種方法對RGS蛋白同源基因進行比對，并結合SMART保守結構域分析，發(fā)現(xiàn)49個真菌所含有的典型RGS蛋白的數(shù)量為229個，其中部分真菌的RGS蛋白數(shù)量與前人報道的RGS蛋白數(shù)量存在一定的差異，其主要原因在于通過OrthoVenn2同源基因簇比對新發(fā)現(xiàn)其他真菌與S.cerevisiaeS288C的4個RGS蛋白氨基酸序列同源的RGS蛋白序列及其利用SMART保守結構域預測分析發(fā)現(xiàn)未含有RGS蛋白保守結構域的RGS-like序列。本研究保守結構域預測未發(fā)現(xiàn)RGS保守結構域的RGS蛋白序列有S.cerevisiae的Mdm1,A.nidulans的GprK，M.oryzae的MoRGS6、MoRGS7、MoRGS8[16]，F(xiàn).verticillioides的RGSC2[17]。保守結構域預測新發(fā)現(xiàn)RGS保守結構域的RGS蛋白序列有M.oryzae的MGG_00295，C.graminicola的GLRG_11166、GLRG_09794，C.higginsianum的CH063_13997、CH063_06702，C.gloeosporioides的CGGC5_1230。此外，F(xiàn).oxysporum存在6個具有DEP-RGS保守結構域的RGS蛋白，與其他48個真菌相比，極為突出，是否與尖孢鐮刀菌的生活習性及致病性相關，有待于今后進一步研究。

同時，為了進一步明確不同真菌分類單元與其所含有RGS蛋白數(shù)量和種類之間的關系，本研究組還根據(jù)49個真菌分類歸屬情況，開展了上述真菌分類單元與其所含有RGS蛋白數(shù)量和種類之間的關聯(lián)分析，結果顯示，上述真菌分屬于16個目(散囊菌目、肉座菌目、小從殼目、酵母目、裂殖酵母目、銹菌目、格孢菌目、長喙殼目、黑粉菌目、核盤菌目、煤炱目、糞殼菌目、銀耳目、盤菌目、白粉菌目、微球黑粉菌目)，以小從殼目、長喙殼目、肉座菌目中的真菌所含有的RGS數(shù)量較多，平均分別為7、6、5.9個，在銹菌目、黑粉菌目、裂殖酵母目中的RGS數(shù)量較少，平均為3個。RGS作為真菌中一類重要的調控蛋白，對于真菌在生長發(fā)育、次生代謝產物及色素合成以及致病性和有性生殖調控等方面均發(fā)揮著重要的作用，推測具有不同數(shù)量RGS蛋白的真菌在上述功能發(fā)揮方面存在著較大的區(qū)別。傳統(tǒng)的植物病理學根據(jù)植物病原真菌侵染植物的過程，分為活體、半活體和死體3種營養(yǎng)類型，其中，活體營養(yǎng)型病原菌主要通過吸收植物的營養(yǎng)成分、半活體和死體營養(yǎng)型病原菌則主要通過降解植物細胞壁來完成生長繁殖。然而，尚未見有關RGS蛋白與真菌營養(yǎng)類型之間關系的研究報道。前人研究發(fā)現(xiàn)，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌的分泌蛋白占總基因的比例高于活體營養(yǎng)型病原菌，半活體和死體營養(yǎng)型病原菌的CAZymes的數(shù)量和占分泌蛋白組的比例顯著高于活體營養(yǎng)型病原菌[8]。本研究對其RGS蛋白的種類和數(shù)量進行研究，明確死體營養(yǎng)型病原菌RGS蛋白數(shù)量高于半活體營養(yǎng)型病原菌，半活體營養(yǎng)型病原菌RGS蛋白數(shù)量高于活體營養(yǎng)型病原菌，且具有RGS-PAS-PAC、TM-RGS兩種motif類型的RGS蛋白主要集中在半活體營養(yǎng)型病原菌和死體營養(yǎng)型病原菌。由此推斷植物病原菌的CAZymes、RGS蛋白與真菌寄生性之間存在較為密切的關系。同時，前人研究發(fā)現(xiàn)半活體和死體營養(yǎng)型病原菌參與植物細胞壁降解的糖苷水解酶家族GH和多糖裂解酶家族PL均發(fā)生了顯著擴增[8]。半活體和死體營養(yǎng)型病原菌的CAZymes數(shù)量和RGS蛋白數(shù)量均多于活體營養(yǎng)型病原菌。今后，對于植物病原菌中的CAZymes、RGS蛋白與真菌寄生性三者之間關系以及作用機制均有待進一步探索，同時，RGS蛋白中的PAS結構域具有參與許多信號蛋白的傳遞功能，其是否與真菌寄生性有著直接關系？RGS蛋白中的TM結構域在RGS結構域前面是否也與病原菌的寄生性有著直接關系，均有待于未來進一步明確。本研究為進一步解析上述真菌的RGS蛋白功能奠定了理論基礎，對植物病原菌的防治具有理論指導意義。