唐 懿 劉彥麟 宋 黎

白血病是世界范圍內的公共衛(wèi)生問題，是常見的血液惡性腫瘤，白血病的惡性程度較高、預后差，通過有效的生物學手段抑制白血病進展顯得極為緊迫[1]。研究表明，白血病中有多種基因表達改變，這些基因有望成為治療白血病的生物靶標，研究白血病的分子發(fā)生機制對于尋找有效的白血病分子標記物具有重要意義[2]。miRNA是長度約為20nt的小分子RNA，在真核生物體內表達廣泛，miRNA生物學功能多樣，其在組織生長、疾病發(fā)生、胚胎發(fā)育、細胞分化等過程中發(fā)揮調控作用[3]。miRNA在人類腫瘤中的作用引起廣泛關注，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個miRNA在腫瘤中表達改變，這些miRNA是潛在的腫瘤治療生物靶標[4]。miR-372在腫瘤中表達改變，影響腫瘤細胞的生長、凋亡，而且在不同來源的腫瘤組織中的作用不同[5]。miR-372在結直腸癌中發(fā)揮促進作用，而在腎細胞癌中發(fā)揮抑制作用[6,7]。既往研究[8]顯示，白血病患者miR-372表達上調，抑制miR-372的表達可減弱白血病細胞的遷移能力。現(xiàn)階段對于miR-372在白血病細胞凋亡中的作用還不明確。本次實驗體外觀察miR-372對白血病細胞U937增殖和凋亡作用并分析其可能機制，以期為白血病的分子靶向治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器

白血病細胞U937購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMEM購自美國Sigma(FG0445)；胎牛血清購自美國GIBCO(10270106)；熒光素酶活性測定試劑盒購自美國Ybscience(YB130597-100)，Bax抗體購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(ml090462)；Bcl-2抗體購自北京百奧萊博科技有限公司(K11176)，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen(11668)；miRNA提取試劑盒(DP501)、miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒(KR201)購自天根生化科技(北京)有限公司；程序性細胞死亡4(Programmde Cell Death 4,PDCD4)抗體購自北京義翹神州科技有限公司(11547)；miR-372 inhibitor和inhibitor control購自吉滿生物科技(上海)有限公司；PDCD4 siRNA、siRNA control由上海吉瑪制藥技術有限公司構建，Multiskan Sky酶標儀購自美國Thermo Fisher；Amnis?ImageStream?X MK Ⅱ流式細胞儀購自德國Merck；DMi1倒置顯微鏡購自德國徠卡。

1.2 細胞轉染和分組

將白血病細胞U937接種到24孔板，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM，于次日細胞密度為50%時采用Lipofectamine 2000進行細胞轉染。轉染操作完全按照轉染試劑說明書進行。轉染miR-372 inhibitor和inhibitor control的白血病細胞命名為Anti-miR-372組和Anti-NC組，把未行轉染的白血病細胞設置為Control組。將PDCD4 siRNA和miR-372 inhibitorsi以及RNA control和miR-372 inhibitor分別共轉染到白血病細胞中，命名為Anti-miR-372+si-PDCD4組、Anti-miR-372+si-NC組。

1.3 qRT-PCR測定miR-372表達

轉染后常規(guī)培養(yǎng)48h,而后收集各組細胞，用D-Hanks液將細胞洗滌2次，1 200g離心10min，棄上清，用miRNA提取試劑盒提取miRNA。miRNA用無RNA酶的ddH2O溶解后，于-80℃環(huán)境中儲存。按照miRNA第一鏈cDNA合成試劑盒進行反轉錄，首先在miRNA的3＇端加Ploy(A)，然后取Ploy(A)修飾以后的miRNA進行逆轉錄反應，逆轉錄反應體系如下：2μl的Poly(A)反應溶液、2μl的RT primer、2μl的RT Buffer、1μl的Super pure dNTPs、1μl的RNasin、0.5μl的Quant RTase，最后加RNase-free ddH2O至20μl，用移液器反復吹打后，37℃反應60min，將cDNA于-20℃冰箱儲存。按照qRT-PCR反應試劑進行PCR反應，在冰上配制PCR體系，包含：Forward Primer和Reverse Primer各0.4μl、1μl的cDNA、10μl的miRcure miRNA premix，最后加RNase-free ddH2O至20μl，擴增條件：94℃ 2min預變性，94℃ 20s，60℃ 34s，一共45個循環(huán)。以U6或CAPDH作為內參，采用2-△△Ct法計算miR-372或PDCD4 mRNA相對表達量。miR-372引物為：Forward Primer 5＇-GCC CGC AAA GTG CTG CGA CAT-3＇，Reverse Primer 5＇-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3＇；U6 Forward Primer 5＇-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3＇，Reverse Primer 5＇-CGC TTC AGA ATT TGC GTG TCA T-3＇。PDCD4 mRNA表達結果以GAPDH作為內參，引物如下：PDCD4 Forward

Primer 5＇-CCA AAG AAA GGT GGT GCA-3＇，Reverse Primer 5＇-TGA GGT ACT TCC AGT TCC-3＇。GAPDH Forward Primer 5＇-CAA CGG ATT TGG TCG TAT T-3’，Reverse Primer 5＇-CAC AGT CTT CTG GGT GGC-3＇。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將各組細胞接種到96孔板，接種時細胞密度為3×104個/ml，每孔100μl細胞懸浮液，于37℃孵育培養(yǎng)24h、48h、72h以后，加10μl的CCK-8工作液，37℃孵育4h以后，用不含細胞孔調零，檢測450nm的A值，A值越大，細胞增殖能力越強。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

Control、Anti-NC、Anti-miR-372組細胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)48h以后，收集各組細胞，1 000g離心10min，棄上清，細胞經(jīng)PBS溶液洗滌2次后加入結合緩沖液400μl，然后分別加入5μl的PI以及5μl的Annexin V-FITC溶液，在避光條件下結合20min，用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2、PDCD4蛋白表達

各組細胞于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱，常規(guī)培養(yǎng)48h以后收集各組細胞，用RIPA蛋白裂解試劑提取細胞總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。將膠板置于電泳儀中，添加電泳液，每個孔內分別加入30μg蛋白樣品(蛋白在添加至凝膠孔之前，需要與Loading Buffer混合煮沸變性)。首先使用80V的電壓電泳30min，然后以120V的電壓電泳2h。將PVDF膜放在甲醇中浸泡1min，然后和濾紙、海綿等一起浸泡在轉移緩沖液中10min。以250mA的電泳轉膜1.5h。將PVDF膜取出，放在5%的脫脂奶粉溶液中，37℃結合1h。再將PVDF膜置于不同濃度稀釋的一抗稀釋液中(Bax、Bcl-2、PDCD4抗體按照1∶800稀釋)，于4℃孵育1h后再將PVDF膜放在HRP標記的二抗稀釋溶液中37℃結合1h(二抗按照1∶4 000稀釋)。配制好ECL顯色試劑，滴加到PVDF膜上，5min后顯影儀顯影。用Image J軟件分析內參GAPDH和目的條帶Bax、Bcl-2、PDCD4的灰度值，以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示該蛋白的相對表達水平。

1.7 miR-372靶向關系預測和鑒定

采用Targetscan生物信息數(shù)據(jù)庫預測miR-372的靶基因，并利用熒光素酶報告系統(tǒng)鑒定miR-372與PDCD4的靶向關系。將PDCD4的3＇UTR端結合位點突變，構建突變型熒光素酶報告載體(PDCD4-MUT)，同時構建沒有突變的野生型熒光素酶報告載體(PDCD4-WT)。PDCD4-MUT和PDCD4-WT由湖南普拉特澤生物科技有限公司構建。將PDCD4-MUT和PDCD4-WT分別與miR-372 inhibitor和inhibitor control共轉染到白血病細胞U937中，培養(yǎng)48h后，用熒光素酶活性測定試劑盒檢測白血病細胞熒光素酶活性。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 miR-372 inhibitor下調白血病細胞中miR-372表達水平

各組細胞miR-372水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Anti-miR-372組白血病細胞中miR-372表達水平明顯低于Anti-NC組(t=15.51，P<0.01)，見表1。

表1 三組白血病細胞中miR-372表達水平比較

2.2 下調miR-372對白血病細胞增殖和凋亡的影響

各組細胞增殖和凋亡水平差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與Anti-NC組比較，Anti-miR-372組白血病細胞24h、48h和72h增殖能力均降低(t=7.38、8.49、22.88，P<0.01)，細胞凋亡率升高(t=31.47，P<0.01)，細胞中Bax蛋白表達水平升高(t=11.71，P<0.01)，Bcl-2蛋白表達水平下降(t=9.60，P<0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義；與Anti-miR-372+si-NC組比較，Anti-miR-372+si-PDCD4組白血病細胞增殖能力升高(t=4.95、8.75、10.76，P<0.01)，凋亡率降低(t=16.40，P<0.01)，Bax蛋白表達水平降低(t=6.56，P<0.01)，Bcl-2蛋白表達水平升高(t=8.84，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。見圖1、圖2和表2。

表2 各組白血病細胞增殖、凋亡以及Bax和Bcl-2蛋白水平比較

圖2 各組白血病細胞Bax、Bcl-2蛋白表達(Western blot)2.3 miR-372與PDCD4靶向調控作用

miR-372與PDCD4的3＇UTR端有互補結合位點；與Anti-NC組比較，共轉染PDCD4-WT后的Anti-miR-372組白血病細胞熒光素酶活性升高(P<0.01)，miR-372與PDCD4互為靶向關系。見圖3和表3。

表3 轉染PDCD4-WT和PDCD4-MUT后白血病細胞熒光素酶活性比較

圖3 miR-372和PDCD4的3＇UTR端結合位點

2.4 下調miR-372對白血病細胞PDCD4表達的影響

各組細胞PDCD4 mRNA和蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與Anti-NC組比較，Anti-miR-372組白血病細胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=11.77、12.90，P<0.01)；與Anti-miR-372+si-NC組比較，Anti-miR-372+si-PDCD4組白血病細胞中PDCD4 mRNA和蛋白表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=18.63、13.73，P<0.01)，見圖4和表4。

圖4 Western blot檢測白血病細胞PDCD4蛋白表達

表4 各組白血病細胞PDCD4 mRNA和蛋白水平比較

3 討 論

miRNA是目前發(fā)現(xiàn)的與腫瘤關系密切的非編碼RNA，miRNA在腫瘤組織以及正常組織中表達改變，這種差異變化往往與惡性腫瘤細胞的凋亡、生長等生物學行為有關，miRNA也成為潛在的腫瘤治療的分子靶標[9]。miR-372作用廣泛，在人體內的多個組織中表達，影響細胞生長[10]。很多研究顯示，miR-372在腫瘤中表達異常，并且miR-372在不同的腫瘤中的作用明顯不同[6,7]。miR-372在鼻咽癌、骨肉瘤等癌癥進展中具有抑制作用，而在乳腺癌、肺癌、結直腸癌等癌癥中發(fā)現(xiàn)miR-372具有促進腫瘤細胞生長的功能[6,11-14]。既往研究表明，miR-372在白血病患者中表達上調，敲低miR-372可降低白血病細胞遷移率[8]。本文結果顯示，下調miR-372的白血病細胞增殖水平降低，細胞凋亡率升高，提示下調miR-372具有抗白血病細胞惡性表型的作用，證明miR-372在白血病中可能發(fā)揮促進功能。

細胞凋亡減少是腫瘤細胞的特點之一。與正常細胞一樣，腫瘤細胞的凋亡受到細胞內諸多基因的調節(jié)，這些基因通過復雜的網(wǎng)絡調控功能共同影響細胞凋亡發(fā)生[15]。Bcl-2是調控細胞凋亡進程的蛋白家族，包含多個蛋白成員，分別在細胞凋亡過程中發(fā)揮促進和抑制作用[16]。Bax是Bcl-2蛋白家族中的促凋亡蛋白，在細胞凋亡過程中表達上調，具有誘導細胞凋亡的作用[17]。Bcl-2是Bcl-2蛋白家族中的抗凋亡蛋白，在細胞凋亡過程中表達下調，具有減少細胞凋亡的作用[18]。本文結果顯示，下調miR-372后的白血病細胞中的Bax蛋白水平升高，Bcl-2蛋白水平下降，提示下調miR-372可誘導白血病細胞凋亡，這與細胞凋亡檢測結果一致。

miRNA雖然沒有編碼蛋白功能，但是其作用卻十分廣泛，這與miRNA調控機制有關[19]。miRNA可以通過堿基互補的方式與靶mRNA的3，UTR端結合，從而阻礙蛋白的表達，miRNA的靶基因有多個，并且在不同的組織中的靶基因可能不同[20]。本研究結果發(fā)現(xiàn)，miR-372與PDCD4互為靶向關系，并且下調miR-372可以提高白血病細胞中PDCD4的表達水平。PDCD4是一種細胞凋亡調節(jié)因子，也是目前發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，PDCD4在腫瘤組織中表達下調，過表達PDCD4可以降低腫瘤細胞的惡性程度[21-23]。本實驗表明，下調PDCD4可以提高下調miR-372的白血病細胞增殖能力，減少細胞凋亡，提示下調miR-372通過靶向PDCD4影響白血病細胞增殖和凋亡。

總而言之，miR-372可能是白血病治療的生物靶標，下調miR-372通過靶向上調抑癌基因PDCD4的表達誘導白血病細胞凋亡、抑制細胞增殖，這種作用機制為白血病的靶向治療提供了可能，也為研究miR-372在腫瘤中的網(wǎng)絡調控機制提供了資料。