李 松 ,陳偉祥,婁燈吉,楊亞麗

(1.玉溪師范學(xué)院 化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院,云南 玉溪 6531001;2.云南佳匯檢測技術(shù)有限公司，云南 玉溪 653100)

玉米育種的重要參考之一是選擇遺傳多樣性豐富的玉米種質(zhì).近年來，我國玉米育種的種質(zhì)基礎(chǔ)狹窄成為共識，種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)狹窄已經(jīng)成為制約我國玉米育種持續(xù)發(fā)展的重要因素[1].這不僅會使我國的玉米育種遇到瓶頸，影響我國玉米育種的質(zhì)量，還會由于某些病害的潛伏而造成嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)危害，使我國玉米生產(chǎn)質(zhì)量下降.因此，我國許多玉米種質(zhì)研究者都將視線轉(zhuǎn)移到了地方品種上，因為我國的許多地方品種具有很多優(yōu)良性狀，如抗倒伏、抗干旱、抗病害、容易適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境等[2].若能最大限度地運用這些地方玉米種質(zhì)的優(yōu)良性狀，則可以有效地緩解目前玉米育種所遇到的瓶頸壓力.通過反饋作用還可以增強(qiáng)現(xiàn)有玉米群體的遺傳多樣性，形成一個良性的循環(huán).我國的地方種質(zhì)普遍在山區(qū)保留，特別是貧困山區(qū)，了解該地方的種質(zhì)遺傳基礎(chǔ)是有效對其利用的前提.

常用的遺傳多樣性研究的方法有：形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記、分子標(biāo)記[3].常用的分子標(biāo)記包括限制性片段多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、簡單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)、 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性 DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)、內(nèi)部簡單重復(fù)序列(Inter-simple sequence repeat，ISSR)、單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)[4，5].SSR與其他分子標(biāo)記如SNP，AFLP等相比，具有以下優(yōu)點：①簡單重復(fù)序列在生物的基因組中隨機(jī)的分布，且具有廣泛的遺傳變異位點，能檢測到的多態(tài)性更高.②SSR標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，可以區(qū)分純合子和雜合子，提供更全面的遺傳信息.③微衛(wèi)星序列的多態(tài)性可以用PCR技術(shù)檢測，PCR技術(shù)簡便，易掌握[6～8].隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行玉米遺傳多樣性研究得到廣泛運用.王鳳格等[9]利用SSR標(biāo)記分析328份玉米品種的遺傳多樣性及遺傳分化特點，表明近年來育成品種遺傳多樣指數(shù)在不同年份間變化不大，除京津唐組之外在其他區(qū)試組間差異也不大；胡德分等[10]用篩選出的70對SSR引物分析19個云南常用自交系玉米，利用聚類分析可將云南19個自交系劃分為4個類群，表明云南自交系遺傳基礎(chǔ)豐富，多態(tài)性好；楊榮志等[11]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)分析川西高原早熟玉米遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)川西高海拔玉米種質(zhì)資源相對獨立，遺傳多樣性豐富.

本研究利用農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(NY/T1432-2014)[12]推薦的SSR核心引物，以云南昭通種植的14個玉米品種為研究材料，進(jìn)行遺傳多樣性分析，闡述不同品種間的遺傳距離，為云南昭通玉米種質(zhì)資源的選育和推廣提供理論和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為云南省昭通市種植的14個玉米品種(表1).

表1 供試玉米品種

1.2 主要儀器及耗材

主要儀器：CT006248 PCR擴(kuò)增儀(BIO-RAD)、Powerpac Universal垂直電泳儀(BIO-RAD)、D-37520臺式冷凍離心機(jī)(Thermo)、TS-200搖床(QILINVEIER)、膠片觀察燈、微量移液器(Thermo)、 AUTOCLAVE. GI54DW高壓滅菌鍋(ZEALWAY)、 PK-80恒溫水浴鍋(精宏)、 LFPM58-68生物安全柜(Thermo)

主要試劑：植物基因組DNA提取試劑盒(HP Plant DNA Kit)、PCR超混液(D331B)、6×Loading Buffer、瓊脂糖、豐科公司的40%聚丙烯酰胺溶液、尿素、親和硅烷、剝離硅烷、無水乙醇、四甲基乙二胺(TMED)、過硫酸銨、冰醋酸、硝酸銀、甲醛、 DNA Marker、異丙醇、異戊醇、三羥甲基氨基甲烷等.

1.3 試驗方法

樣品DNA的提?。?參照Omega:HP Plant DNA kit操作方法)將14份玉米樣品的種子參照植物基因組DNA提取試劑盒的方法提取各樣品DNA，用50 μL TE溶液溶解后于-20℃儲藏.

PCR擴(kuò)增：DNA濃度調(diào)整至50 ng/μL，用于PCR擴(kuò)增特異性產(chǎn)物.反應(yīng)體系為25 μL：模板DNA 2 μL，正、反向引物10 pmol/μL各0.5 μL，Easy Taq Mix 12.5 μL，雙蒸水9.5 μL.PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，60℃退火35 s，72℃延伸45 s，35個循環(huán)，最后4℃保存.

瓊脂糖凝膠電泳檢測：在每個擴(kuò)增樣品中加入4 μL 6×Loading Buffer或自制Loading Buffer(含二甲苯青)混勻后，用濃度為2%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測.

引物篩選：本試驗分別用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1432-2014中推薦的40 對核心引物，用每種引物與14個樣品的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果篩選出特異性條帶.

6%聚丙烯凝膠電泳檢測：將每個樣品的PCR產(chǎn)物經(jīng)95℃變性7 min后，4℃冷卻15 min后，用6%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測，電泳條件：電壓1 500 V，電泳時間45 min.之后取出凝膠用去離子水漂洗10 s后放在10%冰醋酸中固定10 min，去離子水漂洗后在0.1% AgNO3溶液中染色10 min，再用去離子水漂洗后放置1%氫氧化鈉和0.5%甲醛的顯影液中，放置脫色搖床上至條帶清晰后再次漂洗，觀察結(jié)果.

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

本實驗取帶型清晰，按有或無記錄，電泳條帶有時記為“1”，否則記為“0”的原則，建立14個玉米品種的0-1指紋數(shù)據(jù)庫.每個SSR位點的多態(tài)性信息量(Polymorphism information content，PIC) 按公式PIC=1-∑fi2計算，其中fi為i位點的等位基因頻率[13].利用分析軟件Popgene 1.32對篩選出的SSR引物的多態(tài)性、多態(tài)性指數(shù)(polymorphism information content，PIC)[14]、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)和Shannon’s 信息指數(shù)(Shannon’s information index，I)[15]進(jìn)行分析.將生成的數(shù)字化條帶使用NTSYS 2.10e[16]軟件計算不同品種之間遺傳相似系數(shù)(GS,genetic similarity)，使用非加權(quán)配對平均法(UPGMA,unweighted pair-group method with arithmetic means)構(gòu)建聚類圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 聚丙烯酰胺凝膠電泳

通過將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物變性后用聚丙烯酰胺凝膠電泳，引物擴(kuò)增片段大小在150～450 bp，根據(jù)引物條帶多態(tài)性和清晰度，篩選出18對SSR引物，如圖1引物Phi072k4的擴(kuò)增條帶大小符合引物信息.

圖1 引物Phi072k4對14份玉米材料擴(kuò)增的SSR帶型

2.2 引物的多態(tài)性分析

根據(jù)指紋圖譜，18對SSR引物共檢測到87個多態(tài)性片段，每對引物檢測出的特異性多態(tài)片段分別為2～9個，引物Phi065k9和umc1492y13最少，檢測到2個，bnlg161k8最多，檢測到9個，平均每對引物可檢測到4.8個多態(tài)性位點.由表2可以看出Nei’s遺傳多樣性指數(shù)變幅為0.133～0.463，平均為0.335，其中bnlg1940k7的遺傳多樣性指數(shù)最高，為0.463.Shannon 信息指數(shù)變化范圍為0.257～0.655，平均為0.504，且Shannon 信息指數(shù)平均值均在0.5以上.18對引物的PIC變化范圍為0.328～0.848，其中bnlg161k8的PIC最高為0.848，Phi065k9的PIC最低為0.328，平均為0.585.PIC與擴(kuò)增的等位基因的數(shù)目和基因的頻率有關(guān)，它能反映出SSR對品種的區(qū)分度，PIC平均值與材料的遺傳基礎(chǔ)豐富水平呈正關(guān)系[17，18]，當(dāng)PIC≥0.5時，材料遺傳基礎(chǔ)為高度多態(tài)性；0.25≤PIC<0.5時為中度多態(tài)性；PIC<0.25時為低度多態(tài)性.本研究中，18對引物PIC平均值高于0.5，說明14份玉米品種的遺傳基礎(chǔ)豐富，呈高度多態(tài)性.

表2 18對SSR核心引物的多態(tài)性評估

2.3 遺傳多樣性分析

利用NTSYS 2.10e軟件對14份玉米品種進(jìn)行遺傳相似性分析，遺傳相似系數(shù)變幅為0.097～0.802，平均遺傳相似系數(shù)為0.439(表3).大白玉9號與銅玉593遺傳相似系數(shù)為0.802，其兩者之間遺傳相似性較高，遺傳基礎(chǔ)差異最小.而大白玉9號與西抗18的遺傳相似系數(shù)最小，為0.097，遺傳基礎(chǔ)差異最大.

表3 14份玉米的遺傳相似系數(shù)

2.4 聚類分析

基于遺傳相似系數(shù)應(yīng)用UPGMA對14種玉米進(jìn)行遺傳聚類分析.結(jié)果顯示(圖2)，以0.68為閥值可將14個品種分為五大類群，其中第Ⅰ類含2個品種，博玉19和昭黃11；第Ⅱ類含5個品種，羅單566、云大001、同玉213、大天44和大天183；第Ⅲ類有3個品種，金玉2號、大天006和同玉593；第Ⅳ類只含1個品種，貴單10號；第Ⅴ類包括3個品種，西抗18、大白玉9號和云優(yōu)19.

圖2 14個玉米品種的聚類分析

3 討 論

種質(zhì)資源是培育作物優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，是維系國家食物安全的重要保證，而種質(zhì)資源遺傳背景單一化會導(dǎo)致優(yōu)良遺傳資源的丟失.玉米種質(zhì)資源的遺傳多樣性是進(jìn)行玉米遺傳改良的基礎(chǔ).SSR分子標(biāo)記技術(shù)是近年發(fā)展較快和應(yīng)用較廣的研究種質(zhì)資源遺傳多樣性的生物技術(shù).李麗華等[19]利用62對SSR引物研究了135個西南地區(qū)玉米自交系的遺傳多樣性，結(jié)果說明云南地區(qū)的玉米與四川地區(qū)的玉米之間有相對較大的遺傳多樣性，也表明地理來源差異相對較大的材料遺傳多樣性相對較豐富.姚啟倫等[20]利用SSR技術(shù)分別對來自云南和貴州的15個玉米地方品種群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，表明云南和貴州玉米地方品種存在較高的群體內(nèi)遺傳變異，且云南較貴州玉米地方品種的遺傳變異程度更高.劉曉鑫[21]對中國玉米地方品種進(jìn)行SSR標(biāo)記檢測，分析地方品種的遺傳多樣性，結(jié)果表明骨干自交系和西南山地玉米區(qū)的大部分群體結(jié)果單一，說明中國農(nóng)家品種血緣的本土化.劉海忠等[22]為了拓寬玉米自交系的遺傳基礎(chǔ)，加快歐美優(yōu)異種質(zhì)的融入與利用，利用SSR分子標(biāo)記對120份來自美國和塞爾維亞及2份中國的玉米自交系進(jìn)行遺傳多樣性和聚類分析，結(jié)果表明美國NSS和塞爾維亞自交系群比美國SS和中國骨干系群遺傳多樣性高；美國NSS群與美國SS、塞爾維亞兩個群之間的遺傳一致度較高，表明美國與塞爾維亞自交系之間基因交流頻繁，親緣關(guān)系較近，為來自歐美自交系在玉米育種中合理利用提供可靠依據(jù).昭通，位于云貴高原北部斜坡地帶，云貴川三省結(jié)合部，地理及氣候條件復(fù)雜.當(dāng)?shù)氐挠衩追N質(zhì)經(jīng)過長期的自然選擇形成了遺傳多樣性較豐富的山地玉米種質(zhì)資源.

因此，本研究利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1432-2014中篩選的18對SSR引物對云南省昭通種植的14種玉米品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，共檢測到87個多態(tài)性位點，平均每對引物可檢測到4.8個多態(tài)性位點，多態(tài)性指數(shù)(PIC)為0.512～0.812，平均值為0.686，低于姚啟倫等[20]云南的15個玉米地方品種的PIC值0.77，可能經(jīng)過多年種植后，部分玉米種質(zhì)資源本土化，遺傳基礎(chǔ)變窄，但呈高度多態(tài)性.遺傳相似系數(shù)變幅為0.417～0.819，平均遺傳相似系數(shù)為0.632，遺傳差異明顯，以0.65為閥值可將14個品種分為5大類群.根據(jù)不同的育種目標(biāo)，以聚類分析結(jié)果為依據(jù)對地方玉米品種進(jìn)行定向的改良和利用，可為昭通市玉米種質(zhì)資源的選育和推廣提供理論和技術(shù)支持，為今后的玉米育種工作中引進(jìn)不同類型品種和不斷提高云南省種質(zhì)資源基礎(chǔ)的豐富度、品質(zhì)提供科學(xué)依據(jù).