李伶俐 王之發(fā) 李瀟

提高種植體的骨結(jié)合效率一直是研究的熱點?，F(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)可以通過改變種植體形態(tài)結(jié)構(gòu)，表面活化處理等方式來增加其骨傳導(dǎo)性和誘導(dǎo)性[1]。目前種植體材料中使用最廣泛的是具有良好機(jī)械性能的鈦及鈦合金。運用3D打印技術(shù)可讓材料兼具理想外形和精密內(nèi)部結(jié)構(gòu)，降低應(yīng)力屏蔽帶來的不良影響。堿酸熱(alkali-acid-heat,AlAcH)處理是一種簡單的化學(xué)改性方法，可在復(fù)雜的多孔結(jié)構(gòu)表面建立均一疏松的微納米級形貌，同時保持足夠的力學(xué)性能[2]。

黃芩苷(baicalin,BC)是從黃芩的干燥根中提取的主要活性成分，分子式是C21H18O11。研究發(fā)現(xiàn)BC具有多種不同的藥理活性，如抗菌、抗炎和影響骨代謝過程等[3]。然而，國內(nèi)外尚未見有關(guān)BC用于鈦基金屬涂層的報道。本實驗通過研究3D打印Ti-6Al-4V多孔支架堿酸熱處理后負(fù)載BC涂層的機(jī)械性能和對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物學(xué)影響，為種植體表面改性及應(yīng)用BC涂層提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

實驗材料：鈦粉(AP&C,加拿大)；黃芩苷(純度95%，上海麥克林)；CCK-8試劑盒(同仁，日本)；ALP試劑盒(南京建成)；BCA蛋白定量試劑盒(北京康為世紀(jì))；Calcein AM細(xì)胞活力檢測試劑盒(Useverbright，美國)；總RNA提取試劑盒(Thermo Fisher，美國)。實驗細(xì)胞：SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。主要儀器：SLM 3D打印機(jī)(EOS M280，德國)；高壓釜(DHG-9140A)；電子萬能材料試驗機(jī)(INSTRON，美國)；Merlin高分辨場發(fā)射掃描電子顯微鏡(ZEISS，德國)；Acquity UPLC H-Class超高效液相質(zhì)譜聯(lián)用儀(Waters，德國)；倒置熒光顯微鏡(Olympus，日本)；StepOne qPCR儀(Applied Biosystems，美國)。

1.2 設(shè)計并3D打印多孔支架，檢測其彈性模量

用Solidworks軟件繪制300 μm桿徑，600 μm孔徑的同金剛石晶體結(jié)構(gòu)的多孔支架，規(guī)格為Φ10 mm×1.5 mm(壓縮試驗Φ10 mm×15 mm)，傳輸打印。取5 個成品上萬能試驗機(jī)檢測其彈性模量。

1.3 制備實驗樣品

將樣品分別用丙酮、無水乙醇、去離子水超聲清洗15 min，干燥備用。將樣品分為4 組，空白對照組(B)，堿酸熱組(A)樣品處理參照相關(guān)文獻(xiàn)[4](華工)，負(fù)載組分為空白負(fù)載組(B-BC)和堿酸熱負(fù)載組(A-BC)。將BC粉末溶于含DMSO<1%的F12/DMEM培養(yǎng)基(10%FBS)，配置成2 mg/ml BC溶液，每10 ml BC溶液中放置3 個支架，超聲震蕩30 min，清洗后室溫干燥備用。

1.4 表面形貌特征及BC釋放效率

每組各取3 個樣品，通過掃描電鏡觀察表面形貌。將各組樣品浸泡于24孔板中，每組3 片，加入1 ml PBS緩沖液，分別于2、8、24、72 h取出PBS溶液，用超高效液相色譜儀檢測BC的釋放濃度。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

將SD大鼠BMSCs復(fù)蘇后傳代培養(yǎng)，采用F12/DMEM培養(yǎng)基(10%FBS)，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%，用胰酶消化后傳代1 次，待細(xì)胞穩(wěn)定后用于后續(xù)實驗。

1.6 BMSCs增殖情況

將樣品放入48孔板中，每孔一個樣品，取生長狀態(tài)良好的BMSCs制備成細(xì)胞懸液，以1×104/孔的密度接種于48 孔板中,共培養(yǎng)2、4、7 d后取出樣品按Calcein AM產(chǎn)品說明書檢測。

1.7 ALP活性檢測

將樣品放于24孔板中，每孔一個樣品，取BMSCs細(xì)胞懸液，以2×105/孔的密度接種于24孔板中，共培養(yǎng)7、14 d后取出樣品，去離子漂洗2 遍后放于新24孔板，每孔加入Western及IP細(xì)胞裂解液60 μl，裂解30 min，吹打收集裂解液后12 000×g高速低溫離心20 min，收集上清液按說明書檢測。

1.8 RT-qPCR

細(xì)胞培養(yǎng)7、14 d后，按說明書提取總RNA，按試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，β-ACTIN作為內(nèi)參基因。實時定量熒光PCR：10 μl反應(yīng)體系，實驗操作按說明書進(jìn)行，實時定量PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 1 min，40循環(huán)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 3D打印設(shè)計成品并檢測彈性模量

為保證多孔支架的機(jī)械強(qiáng)度，本實驗采用金剛石晶體結(jié)構(gòu)設(shè)計，打印獲得孔孔相通的網(wǎng)格支架(圖 1)。壓縮試驗測得樣品彈性模量為(644.00±38.47) MPa，符合人體骨的彈性模量(0.2～2) GPa[2]。

2.2 表面形貌分析

掃描電鏡觀察各組樣品表面結(jié)構(gòu)(圖 2)，可見大量未完全融化的微球。B組支架結(jié)構(gòu)連續(xù)，沒有明顯裂痕。A組可見表面微球數(shù)量有所減少，與B組相比表面粗糙，可見表面結(jié)構(gòu)明顯改變，形成微納米級的疏松草叢狀結(jié)構(gòu)。負(fù)載組均可見支架表面有殼層結(jié)構(gòu)，殼層在支架微球邊緣會出現(xiàn)裂隙，高倍鏡下可見A-BC組殼層表面也有明顯淺凹結(jié)構(gòu)而B-BC組殼層表面依然連續(xù)平整，這與涂層底部結(jié)構(gòu)相對應(yīng)。

2.3 BC涂層釋放效率

經(jīng)過相同濃度BC溶液處理的各組樣品顯示出不同的負(fù)載能力(圖 3)。A-BC組負(fù)載量多于B-BC組，平行組間濃度差更小，負(fù)載能力更加穩(wěn)定，且緩釋速率最快。緩釋3 d后2 組釋放量接近，但A-BC組的BC濃度始終比A-BC組高。這表明堿酸熱處理后的Ti-6Al-4V多孔支架更有利于BC涂層的負(fù)載。

圖 1 3D打印成品設(shè)計圖

圖 2 不同放大倍數(shù)下的各組樣本表面SEM形貌

圖 3 B-BC組和A-BC組黃芩苷涂層釋放曲線

2.4 BMSCs增殖情況

A值提示BMSCs在各組支架上生長2、4、7 d時均能持續(xù)增殖(圖 4)。A-BC組和B-BC組在第2、4天時細(xì)胞增殖速度較B組慢(P<0.05)。在第7天時，A-BC組細(xì)胞增殖速度明顯高于A組和B-BC組(P<0.05)，但與B組無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

2.5 BMSCs中ALP活性檢測

在7 d時，A組、A-BC組、B-BC組細(xì)胞內(nèi)ALP活性均高于B組(P<0.05)。在14 d時各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)(圖 5)。

2.6 RT-qPCR結(jié)果

BMSCs培養(yǎng)7 d后，實驗組中BSP和OCN的mRNA表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，其中A-BC組BSP的mRNA水平明顯高于其他組，B-BC組OCN的mRNA水平明顯高于其他組(P<0.05)。細(xì)胞培養(yǎng)14 d后，各實驗組BSP 的mRNA水平均高于對照組(P<0.05)，A-BC組BSP的 mRNA水平高于B-BC組(P<0.05)，B-BC組和A-BC組的OCN的mRNA水平高于其他組(P<0.05)(圖 6)。

圖 4 各組多孔支架表面對BMSCs增殖的影響 圖 5 第7、14天各組BMSCs ALP活性

for 2, 4 and 7days 7 and 14 days

圖 6 培養(yǎng)第7、14天各組多孔支架表面BMSCs的OCN、BSP基因表達(dá)情況

3 討 論

傳統(tǒng)的鈦基種植體彈性模量遠(yuǎn)大于人正常骨，在種植體承重時會與骨組織發(fā)生相對位移，發(fā)生“應(yīng)力屏蔽”從而影響骨結(jié)合過程[5]。目前對于種植體形態(tài)的研究都側(cè)重于模擬骨小梁的幾何和力學(xué)特性。有研究發(fā)現(xiàn)孔徑為200～1 000 μm的支架在保證強(qiáng)度情況下還能為組織生長提供更多空間[2]。3D打印技術(shù)可控制材料的孔隙大小和孔隙率，從而降低材料的彈性模量?？紫断嗤ǖ?維結(jié)構(gòu)利于細(xì)胞遷移、血管化、氧氣運輸和營養(yǎng)物質(zhì)代謝[1]。本實驗中結(jié)合結(jié)構(gòu)設(shè)計和3D打印工藝，可以獲得與人體骨相似彈性模量的鈦合金多孔支架。為了提高鈦基種植體的骨結(jié)合程度，目前常用的方法有種植體表面改性及涂層技術(shù)[6]。將鈦合金進(jìn)行堿酸熱處理即可在表面形成具有微納米級粗糙度的帶正電荷的氧化鈦層，并具有一定骨誘導(dǎo)性[7]。從本實驗掃描電鏡結(jié)果看出堿酸熱處理后材料表面形成了微納米級的叢狀結(jié)構(gòu)，這與之前的研究結(jié)果一致[4]。

BC的分子結(jié)構(gòu)式中帶有多個酚羥基，酚羥基是具有弱酸性帶負(fù)電荷的，不僅可以與金屬離子結(jié)合還可以與蛋白分子上的正電荷結(jié)合[8]。本實驗中BC涂層通過物理沉積負(fù)載于金屬表面，從釋放曲線可以看出A-BC組負(fù)載涂層濃度更高，負(fù)載濃度更一致，并且負(fù)載效率更高?？赡艿脑蚴窃谪?fù)載涂層過程中帶負(fù)電荷的BC溶液可以與帶正電荷的堿酸熱處理金屬表面通過靜電作用和物理吸附相結(jié)合。另外BC還具有高效低毒和誘導(dǎo)成骨的特性[9]，從本實驗中CCK-8檢測A值可見BMSCs在各組材料上隨著時間的延長都發(fā)生增殖。在培養(yǎng)2、4 d時，實驗組A值小于對照組(P<0.05)，說明實驗組對BMSCs的增殖沒有促進(jìn)作用，可能的原因是細(xì)胞增殖與分化存在相反關(guān)系[10]。但在7 d時，A-BC組A值明顯高于其他實驗組(P<0.05)，提示在后期堿酸熱處理負(fù)載BC涂層與其他表面處理相比能加快BMSCs增殖速度。ALP被認(rèn)為是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志之一，參與骨形成、代謝和再生等過程[11]。從ALP的結(jié)果中可以看出7 d時BC涂層組表面BMSCs內(nèi)的ALP活性高于對照組(P<0.05)。但是14 d時BMSCs的ALP活性較7 d時低，可能的原因是BMSCs細(xì)胞從分化期向下一礦化期轉(zhuǎn)變，這一結(jié)果與之前的研究結(jié)果一致[12]。在BMSCs分化的不同階段，細(xì)胞會表達(dá)相應(yīng)的基因。OCN和BSP是與細(xì)胞分化成熟密切相關(guān)的蛋白，OCN活躍于間充質(zhì)干細(xì)胞分化晚期[13]。BSP不僅與細(xì)胞成骨分化有關(guān)，還影響到骨基質(zhì)的礦化。在本實驗中發(fā)現(xiàn)B-BC組與A-BC組在第7和14天時，BSP和OCN的基因表達(dá)水平均高于對照組(P<0.05)，A-BC組的BSP的基因表達(dá)水平高于B-BC組(P<0.05)，這提示BC涂層有利于提高BMSCs的成骨分化能力，堿酸熱處理結(jié)合BC涂層可促進(jìn)骨基質(zhì)的礦化。該結(jié)果與之前研究結(jié)果一致[14]?？赡艿脑蚴荁C通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號而促進(jìn)BMSCs的分化成熟[15]。

本實驗結(jié)果表明通過3D打印技術(shù)可以獲得與人體骨彈性模量相似的鈦合金多孔支架，經(jīng)過堿酸熱處理和負(fù)載BC涂層后仍具有良好的生物相容性，可以促進(jìn)BMSCs的成骨向分化。未來的研究可以深入探討不同濃度BC涂層對BMSCs增殖分化的影響以及體內(nèi)實驗中該多孔支架的成骨情況。為今后種植體表面修飾中藥涂層方面提供了一個新的選擇。