黎丹，毛婕，李燦，張文慶

（1. 有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275；2. 貴州省山地珍稀動(dòng)物與經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴陽(yáng)學(xué)院生物與環(huán)境工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550005）

水稻作為主要的糧食作物，在亞洲的種植面積約占全世界的90%。我國(guó)的水稻生產(chǎn)受到眾多的病蟲(chóng)害影響，其中褐飛虱（Nilaparvata lugens，BPH）是危害極為嚴(yán)重的害蟲(chóng)之一。褐飛虱屬半翅目飛虱科（Homoptera： Delphacidae）昆蟲(chóng)，為專(zhuān)食性害蟲(chóng)，只在水稻上取食和繁殖后代，是一種遠(yuǎn)距離遷飛的害蟲(chóng)，在夏季多雨時(shí)易暴發(fā)成災(zāi)［1-2］。目前，褐飛虱的防治方式主要有農(nóng)業(yè)防治、生物防治、物理防治、化學(xué)防治等。

基于RNAi（RNA 干擾）技術(shù)的基因農(nóng)藥被稱(chēng)為重大顛覆性產(chǎn)品［3］。2017 年，孟山都公司研發(fā)的第一個(gè)以RNA 干擾技術(shù)為基礎(chǔ)的殺蟲(chóng)劑正式被美國(guó)環(huán)保署批準(zhǔn)（http：//www.biotech.org.cn/information/147718）。目前，RNAi 技術(shù)用于害蟲(chóng)防治時(shí)，RNAi靶基因的篩選至關(guān)重要。篩選的RNAi靶基因應(yīng)同時(shí)具備安全性和高效性?xún)纱筇攸c(diǎn)。安全性，即害蟲(chóng)攝入的靶基因dsRNA 對(duì)非目標(biāo)生物和環(huán)境友好。高效性，即害蟲(chóng)攝入低劑量的靶基因dsRNA 后，不能正常生長(zhǎng)發(fā)育直到死亡或出現(xiàn)繁殖力減弱、交配能力低下等現(xiàn)象。近年來(lái)，已報(bào)道的具有應(yīng)用潛力的RNAi 靶基因有Hsp90、轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物Ⅲ亞基Snf7、幾丁質(zhì)合成酶基因A（CHSA）、蛻皮激素受體EcR等［4-7］。

為更有效獲得安全高效的RNAi 靶標(biāo)基因，本文通過(guò)大規(guī)模篩選和文獻(xiàn)閱讀建立了一套安全高效RNAi 靶基因的篩選流程，得到了32 個(gè)致死候選基因，并檢測(cè)了其中12個(gè)基因的RNAi效率。進(jìn)一步對(duì)其中的轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物Ⅲ亞基Snf7同源基因（簡(jiǎn)稱(chēng)為NlSnf7）的控害效果進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

褐飛虱（N. lugens）種群由廣東省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所提供，白背飛虱（Sogatella furcifera）采集于廣東省農(nóng)科院植物保護(hù)研究所的鐘落潭水稻種植基地，兩者均在昆蟲(chóng)飼養(yǎng)溫室中用分蘗期的黃華占品種水稻飼養(yǎng)。飼養(yǎng)溫室的相對(duì)濕度為(80±10)%，溫度為(27±2)℃，光照周期為L(zhǎng)∶D=16∶8 h。亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）由本實(shí)驗(yàn)室用人工飼料飼養(yǎng)。

1.2 安全高效RNAi靶基因的獲得

首先，將Flybase（http：//flybase. org/）和iBeetle-base（http：//ibeetle-base.uni-goettingen.de/）中進(jìn)行過(guò)RNAi 相關(guān)基因的ID、表型、突變類(lèi)型、序列名稱(chēng)等進(jìn)行整理，并將相對(duì)應(yīng)的基因序列提取出來(lái)整理成FASTA 文件。然后，將整理得到的基因序列與本實(shí)驗(yàn)室的褐飛虱轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行同源比對(duì)，再將比對(duì)得到的序列于Blast2GO 進(jìn)行GO注釋及分析。同時(shí)，將比對(duì)得到的序列與脊椎動(dòng)物進(jìn)行同源比對(duì)，選取Unmapped 的序列，作為安全候選基因，最后再結(jié)合Flybase 和ibeetle-base 兩大數(shù)據(jù)庫(kù)分析其致死表型，獲得候選靶基因。此外，通過(guò)文獻(xiàn)閱讀，選取高致死率（＞90%）的序列作為高效候選基因，最后通過(guò)設(shè)計(jì)特異性dsRNA片段，獲得安全高效RNAi候選靶基因。

1.3 dsRNA的合成及注射

將篩選到的候選靶基因根據(jù)dsRNA 引物設(shè)計(jì)原則，利用Editseq 軟件分析序列的ORF 區(qū)，利用primer5.0 軟件設(shè)計(jì)包含ORF 區(qū)的特異性引物（表1）。再將設(shè)計(jì)得到的序列通過(guò)本地blast 檢測(cè)脫靶效應(yīng)，分別構(gòu)建含有dsRNA 片段的重組質(zhì)粒，陽(yáng)性克隆經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，分別命名為ds-基因名，按照Promega T7 RiboMAX?Express RNAi System 試劑盒的方法合成dsRNA。最后將獲得的dsRNA 用w=1%的瓊脂糖凝膠和NanoDrop ND-2000 超微量紫外分光光度計(jì)分別進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和濃度測(cè)定，最終將其稀釋至5 μg/μL，保存于－20 ℃。

表1 12個(gè)特異性dsRNA片段的合成引物Table 1 Synthetic primers for 12 specific dsRNA fragments

續(xù)表

1.4 褐飛虱NlSnf7基因的時(shí)空表達(dá)

褐飛虱齡期和組織模板的收集、褐飛虱和亞洲玉米螟總RNA 的提取及cDNA 的合成均見(jiàn)文獻(xiàn)［8］。利用primer5.0 軟件設(shè)計(jì)q-PCR 的特異性引物，內(nèi)參基因選取β-Actin（表2）。以反轉(zhuǎn)錄得到的褐飛虱各個(gè)時(shí)期和各個(gè)組織cDNA 為模板，利用KAPA SYBR?FAST qPCR Master Mix 試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR。其反應(yīng)體系為：KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix（2×）16.5 μL，cDNA 模板1 μL，q-PCR 上下游引物各0.7 μL，ddH2O 14.1 μL，總體系為33 μL。將上述反應(yīng)液分裝到3 個(gè)孔中，每孔10 μL。q-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，然后95 ℃變性3 s，60 ℃退火20 s，40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)q-PCR 的擴(kuò)增曲線(xiàn)和融解曲線(xiàn)。定量數(shù)據(jù)由LightCycler480儀器自帶的軟件分析導(dǎo)出，導(dǎo)出數(shù)據(jù)為Ct 值。Ct 值表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

1.5 褐飛虱NlSnf7基因的致死效應(yīng)和安全性檢測(cè)

1.5.1 干擾效率檢測(cè)

注射法：取短翅型成蟲(chóng)1 d 的雌性褐飛虱或白背飛虱，用CO2將其吹暈后置于注射盤(pán)，并使其腹部朝上，最后注射其腹面口器末端右側(cè)，注射后將褐飛虱和白背飛虱放回溫室分蘗期的水稻上繼續(xù)飼養(yǎng)，其中褐飛虱的注射總劑量每頭分別為50、10、1 和0.1 ng，白背飛虱每頭為200 ng。取5 齡2 d 的亞洲玉米螟，先用酒精棉球?qū)τ紫x(chóng)體表進(jìn)行消毒，然后用吸取好注射液毛細(xì)管在幼蟲(chóng)倒數(shù)第二對(duì)腹足處進(jìn)行快速注射，再將幼蟲(chóng)放入飼料中培養(yǎng)，亞洲玉米螟的注射總劑量每頭為20 μg。最后隨機(jī)選取注射后24、48 和72 h 的褐飛虱和白背飛虱各3 頭；隨機(jī)選取注射后48、60 和72 h 的亞洲玉米螟各3頭，按照1頭/組進(jìn)行分組，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄后利用q-PCR 技術(shù)檢測(cè)其體內(nèi)各基因的變化。

飼喂法：將合成的dsRNA 與褐飛虱人工飼料分別配制成50、10、1 和0.1 ng/μL 的混合飼料。取大小一致的4齡褐飛虱若蟲(chóng)進(jìn)行飼喂，飼喂后的褐飛虱若蟲(chóng)放入人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h 更換一次飼料。最后隨機(jī)選取飼喂后第1、3、5 和7 天的褐飛虱各9 頭，按照3 頭/組進(jìn)行分組，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄后利用q-PCR 技術(shù)檢測(cè)其體內(nèi)各個(gè)基因的變化。

1.5.2 RNAi后致死率的統(tǒng)計(jì)

注射法：取短翅型成蟲(chóng)1 d 的雌性褐飛虱，用CO2將其吹暈后置于注射盤(pán)，并使其腹部朝上，最后注射其腹面口器末端兩側(cè)，注射后將褐飛虱放回溫室分蘗期的水稻上繼續(xù)飼養(yǎng)，然后統(tǒng)計(jì)注射后13 d內(nèi)的褐飛虱死亡數(shù)量。

飼喂法：取大小一致的4齡褐飛虱若蟲(chóng)飼喂混有50、10、1 和0.1 ng/μL 4 個(gè)低劑量dsRNA 的人工飼料，飼喂后的褐飛虱若蟲(chóng)放入人工氣候培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h 更換一次飼料，并統(tǒng)計(jì)飼喂9 d內(nèi)的褐飛虱死亡數(shù)量。

1.5.3 RNAi后蛋白變化的檢測(cè) 隨機(jī)收集每頭注射10 ng dsRNA 片段后第1 天和第5 天的褐飛虱各9頭，每3 頭一組，共3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，進(jìn)行總蛋白的提取，于4 ℃保存。然后配制SDS-PAGE 膠進(jìn)行Western blot 檢測(cè)。所用的SDS-PAGE 分離膠為w=10%，蛋白上樣量為20 μg。電泳時(shí)程序的是80 V，30 min，100 V，50 min。轉(zhuǎn)膜時(shí)的程序是100 V，50 min。孵育一抗時(shí)，NlSnf7 的效價(jià)為1∶3 000，β-Actin 的效價(jià)為1∶5 000；孵育二抗時(shí)，兩者的效價(jià)均為1∶5 000。

表2 定量PCR引物Table 2 Quantitative primers

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

基因的相對(duì)定量數(shù)據(jù)的差異計(jì)算按照△△Ct法，并使用β-Actin 的mRNA 表達(dá)量進(jìn)行校正［9］。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用t 檢驗(yàn)分析處理組和對(duì)照組之間基因表達(dá)量的差異，P ＜0.05表示差異顯著，以符號(hào)“*”標(biāo)記；P ＜0.01 表示差異極顯著，以符號(hào)“**”標(biāo)記。褐飛虱的死亡情況用校正死亡率進(jìn)行表示，其公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 安全高效RNAi靶基因的獲得

為獲得安全高效RNAi 靶基因，本文建立了安全高效RNAi 靶基因的篩選流程（圖1）。首先將本實(shí)驗(yàn)室的褐飛虱轉(zhuǎn)錄本序列與Flybase 和ibeetlebase 兩大數(shù)據(jù)庫(kù)中RNAi 過(guò)的序列進(jìn)行同源比對(duì)，獲得2 996 條基因序列，其中2 481 條有GO 注釋。再將2 996 條基因與脊椎動(dòng)物進(jìn)行同源比對(duì)，保真值為10-5，獲得unmapped 序列141 條。分析該141個(gè)基因的GO 注釋數(shù)目，發(fā)現(xiàn)大部分基因的GO 號(hào)注釋數(shù)目在1～5個(gè)之間，說(shuō)明篩選出來(lái)的基因功能都較簡(jiǎn)單，安全性較高；其中有致死表型且序列ORF 區(qū)大于350 bp 的序列有15 條。將這15 個(gè)基因進(jìn)行特異性dsRNA 片段設(shè)計(jì)，再將dsRNA 片段于NCBI 中進(jìn)行Blastx，發(fā)現(xiàn)其中12 個(gè)基因的dsRNA片段只與褐飛虱同源，其分別是中心體(centrosomin, Cnn)、 周 期 蛋 白 (cycle protein, Cyc)、LOC111054118(基因名簡(jiǎn)稱(chēng)為Nl026080)、神經(jīng)肽G蛋白偶聯(lián)受體A10(neuropeptide G proteincoupled receptor A10，NGR-A10)、β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白樣(Beta-1,3-glucan-binding protein-like，GRP3)、羽化激素(eclosion hormone, Eh)、鋅指蛋白Chinmo(zinc finger protein chinmo，Chinmo)、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(juvenile hormone acid O-methyltransferase,Jhamt)、酚氧化酶1(prophenoloxidase 1,PPO1)、超級(jí)雙胸(ultrabithorax, Ubx)、超氧化物歧化酶1 (superoxide dismutase[Cu-Zn]-like,Sod1)、眼缺陷同源物4（Eyes absent homolog 4-like，Eya4）。

通過(guò)文獻(xiàn)閱讀，將Baum 等獲得的15個(gè)高效致死基因于Flybase 和Wormbase（https：//wormbase.org/）下載相對(duì)應(yīng)的蛋白序列，再與實(shí)驗(yàn)室褐飛虱轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行tblastn，獲得92 條比對(duì)序列；然后于NCBI 中進(jìn)行Blastx 和E 值分析，發(fā)現(xiàn)有15 個(gè)同源基因；最后將其進(jìn)行特異性dsRNA 片段的設(shè)計(jì)，并將設(shè)計(jì)的dsRNA 片段于NCBI 中進(jìn)行Blastx［10］。結(jié)果發(fā)現(xiàn)外殼蛋白復(fù)合物1 亞基β(putative coatomer subunit beta，CopI-β)、跨膜ATP 酶亞基D（putative v-ATPase subunit D，v-ATPase-D）、核糖體蛋白S4(putative 40S ribosomal protein S4,RPS4)、核糖體蛋白L9(putative 60S ribosomal protein L9,RpL9)、核糖體 蛋 白S14A（putative ribosomal protein S14A，RPS14A）、外殼蛋白復(fù)合物1 亞基β′(putative coatomer subunit β‘-like，CopI-β′)、核糖體蛋白L19(putative 60S ribosomal protein L19，RpL19)、帶電多泡體蛋白2A（putative charged multivesicular body protein 2a-like，CHPM2A）和轉(zhuǎn)運(yùn)必需內(nèi)吞體復(fù)合物Ⅲ亞基Snf7(putative ESCRT Ⅲ_Snf7 ortholog,Snf7)的dsRNA 片段安全性較高。此外，將Ulrich 等在赤擬谷盜RNAi 后致死率達(dá)100%的11 個(gè)基因于ibeetlebase下載相對(duì)應(yīng)的蛋白序列，再與實(shí)驗(yàn)室褐飛虱轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行tblastn，獲得161 條比對(duì)序列，最后經(jīng)NCBI Blastx 和E 值分析和設(shè)計(jì)特異性dsRNA 片段后，發(fā)現(xiàn)有8個(gè)安全性較高的dsRNA片段，分別是NF-kappa-B inhibitor cactus-like isoform X1Cact)、信號(hào)識(shí)別粒子54 000 蛋白(signal recognition particle 54 000 protein,Srp54k)、Protien ROP（ROP）、α可溶性NSF 附著蛋白(alpha-soluble NSF attachment protein, αSnap)、熱休克蛋白70-2（heat shock protein 70-2，Hsp70-2）、26S 蛋白酶體non-ATPase 調(diào)節(jié)亞基6（26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 6，PSMD6）、Protein Gawky (Gw) 和ATP 酶家族3A結(jié)構(gòu)域含蛋白2 樣亞型X1(ATPase family AAA domain-containing protein 2-like isoform X1,Atad2)[11]。

圖1 褐飛虱安全高效RNAi靶基因的篩選流程Fig.1 The screening process of safe and efficient RNAi target genes of BPH

為確保dsRNA 片段的可操作性、安全性和高效性，進(jìn)一步制定了篩選的原則：一是ORF 區(qū)的長(zhǎng)度大于500 bp，便于設(shè)計(jì)dsRNA 和引物；二是設(shè)計(jì)的dsRNA 片段只與褐飛虱同源或與兩種稻飛虱同源；三是選擇已知RNAi 后有極高死亡率的基因或昆蟲(chóng)特異性基因。基于上述篩選原則，選擇了中心體(NlCnn)、LOC111054118(Nl026080)、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶(NlJhamt)、外殼蛋白復(fù)合物1 亞基β(NlCopI-β)、核糖體蛋白L9(NlRpL9)、眼缺陷(NlEya4)、 NF-kappa-B inhibitor cactus-like isoform X1(NlCact)、26S 蛋白酶體non-ATPase 調(diào)節(jié)亞基6（NlPSMD6）、Protein Gawky(NlGw)、幾丁質(zhì)合成酶A(NlCHSA)、 轉(zhuǎn) 運(yùn) 必 需 內(nèi) 吞 體 復(fù) 合 物Ⅲ亞基Snf7同源基因(NlSnf7)和帶電多泡體蛋白2A（NlCHMP2A）共 12 個(gè) 基 因 進(jìn) 行 后 續(xù) 的 研究（表3）。

表3 特異性dsRNA片段Table 3 Specific dsRNA fragments

2.2 安全高效RNAi靶基因的初篩

采用注射法RNAi技術(shù)分析上述12個(gè)靶基因的RNAi 效率。首先合成了12 個(gè)基因的dsRNA 片段，然后以低劑量（每頭10 ng）注射成蟲(chóng)一天雌性褐飛虱，檢測(cè)注射后24、48和72 h的RNAi效率。結(jié)果 顯 示NlCnn、Nl026080、NlJhamt、NlCopI-β、NlRpL9、 NlPSMD6、NlCHSA 和NlSnf7 8 個(gè)基因在注射后3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的mRNA 表達(dá)水平均極顯著下降（圖2）；其中NlSnf7 是基于已有研究篩選出來(lái)的管家基因，在玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera） 的研究中， DvSnf7 表現(xiàn)出高效致死性［10，12］，表明NlSnf7有較高的研究?jī)r(jià)值。

2.3 NlSnf7基因的時(shí)空表達(dá)

褐飛虱不同齡期的定量PCR 結(jié)果顯示，NlSnf7在褐飛虱各個(gè)發(fā)育歷期均有表達(dá)，在成蟲(chóng)期的表達(dá)量明顯高于若蟲(chóng)期，并在成蟲(chóng)第11天達(dá)到頂峰；不同組織的定量PCR結(jié)果顯示，NlSnf7在頭部的表達(dá)量最高，其次分別是卵巢、表皮、足、脂肪體和中腸組織（圖3）。

2.4 NlSnf7基因的致死效應(yīng)和安全性檢測(cè)

2.4.1 注射法致死效應(yīng) 利用注射法RNAi 技術(shù)，檢測(cè)了每頭注射劑量為50、10、1 和0.1 ng 4 個(gè)低劑量的RNAi 干擾效率，發(fā)現(xiàn)dsNlSnf7 在4 個(gè)低劑量干擾48 h 后，基因表達(dá)水平均極顯著下降（圖4）。為進(jìn)一步研究dsNlSnf7片段的致死效率，分別統(tǒng)計(jì)了注射4 個(gè)低劑量dsNlSnf7 后13 d 內(nèi)雌性褐飛虱的校正死亡率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射不同劑量dsNlSnf7后的褐飛虱校正死亡率持續(xù)上升，其中在第13 天的校正死亡率分別為75.05%、63.93%、49.44%和23.04%（圖4）。

2.4.2 飼喂法致死效率 為了模擬田間環(huán)境，利用飼喂法RNAi 技術(shù)對(duì)褐飛虱進(jìn)行致死效率檢測(cè)。通過(guò)飼喂褐飛虱4 齡若蟲(chóng)50、10、1 和0.1 ng/μL 4個(gè)低劑量dsNlSnf7 的人工飼料，發(fā)現(xiàn)NlSnf7 的RNAi 干擾效率處于相對(duì)動(dòng)態(tài)的過(guò)程。NlSnf7 的基因表達(dá)水平在飼喂50 ng/μL 劑量后的4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著下降；在飼喂10 ng/μL 劑量的第3 天后顯著下降；在飼喂1 ng/μL 劑量第5 天后顯著下降；在飼喂0.1 ng/μL 劑量后，與對(duì)照組相比有下降趨勢(shì)，但不顯著（圖5）。之后統(tǒng)計(jì)了對(duì)褐飛虱分別飼喂4個(gè)不同劑量dsNlSnf7 后9 d 內(nèi)的校正死亡率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第9 天的校正死亡率分別為50.24%、32.69%、23.33%和11.04%，表明飼喂低劑量的dsNlSnf7也具有一定的致死效應(yīng)（圖5）。

圖2 12個(gè)基因的RNAi效率Fig.2 The RNAi efficiency of 12 genes

圖3 NlSnf7的齡期和組織表達(dá)模式Fig.3 The expression patterns of NlSnf7 at different ages and tissues

圖4 注射dsNlSnf7后的干擾效率和校正死亡率Fig.4 The interference efficiency and the corrected mortality rate after injection dsNlSnf7

圖5 飼喂dsNlSnf7后的干擾效率和校正死亡率Fig.5 The interference efficiency and the corrected mortality rate after feeding dsNlSnf7

2.4.3 蛋白變化和安全性檢測(cè) 為了驗(yàn)證注射dsNlSnf7后褐飛虱相對(duì)應(yīng)基因的蛋白水平是否也發(fā)生變化，分別收集每頭注射劑量10 ng dsRNA 片段后第1 天和第5 天的褐飛虱進(jìn)行蛋白水平檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射dsNlSnf7后的NlSnf7蛋白表達(dá)量均顯著降低（圖6）。同時(shí)，為了驗(yàn)證dsNlSnf7 片段對(duì)其他物種的安全性問(wèn)題，選擇無(wú)連續(xù)21 bp 相同序列的亞洲玉米螟（O. furnacalis） 和白背飛虱（S.furcifera）進(jìn)行dsNlSnf7 注射。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組（注射dsGFP）相比，實(shí)驗(yàn)組均無(wú)顯著變化，說(shuō)明dsNlSnf7片段的安全性較高。

3 結(jié)論與討論

害蟲(chóng)防治既要保證效果，又要保證安全性。本文建立的安全高效RNAi 靶基因的篩選流程包括兩條途徑：實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組分析和文獻(xiàn)閱讀（圖1）。該篩選流程將現(xiàn)有的兩大RNAi 靶基因篩選策略進(jìn)行了整合，分別是大規(guī)?；蚋咄縍NAi 靶點(diǎn)篩選策略和基于已知功能基因?qū)ふ彝椿虻暮Y選策略，這與現(xiàn)有研究的單一篩選流程相比，綜合性更強(qiáng)［13-15］。

Snf7 是一類(lèi)保守的空泡分選蛋白，是ESCRT-Ⅲ的一個(gè)核心亞基，存在除古細(xì)菌外的所有生物中［16］；Snf7在果蠅中的同系物為Shrb（Shrub），在人類(lèi)的同系物為CHMP4［17］。本文研究的NlSnf7 在褐飛虱的整個(gè)發(fā)育歷期均有表達(dá)，說(shuō)明NlSnf7 是褐飛虱的管家基因（圖3）。目前，Snf7 在鞘翅目玉米根螢葉甲中的研究最多［5，10，18-19］，但還未在褐飛虱中開(kāi)展相關(guān)研究。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)飼喂褐飛虱四齡若蟲(chóng)低劑量的dsNlSnf7的校正死亡率會(huì)稍低于飼喂玉米根螢葉甲二齡幼蟲(chóng)低劑量的dsDvSnf7 的校正死亡率［12］，推測(cè)這一結(jié)果可能與昆蟲(chóng)口器類(lèi)型及昆蟲(chóng)齡期有關(guān)。褐飛虱屬于刺吸式口器昆蟲(chóng)，與玉米根螢葉甲的咀嚼式口器相比，其通過(guò)飼喂法獲取的dsRNA 量較少。此外有研究表明，昆蟲(chóng)齡期越小，死亡率越高［20-21］。同時(shí)RNAi 靶基因的效果可能與昆蟲(chóng)物種也密切相關(guān)，如飼喂同為刺吸式口器的煙草薊馬（Thrips tabaci）500 ng/μL 高劑量的dsSnf7 后，其死亡率為72%［22］；飼喂茄二十八星瓢蟲(chóng)（Henosepilachna vigintioctopunctata）5 ng/μL 的dsSnf7，可導(dǎo)致54%的死亡率［23］；飼喂非洲甘薯象鼻蟲(chóng)（Cylas brunneus）1 μg/mL 的dsSnf7，其死亡率可達(dá)69.1%［24］。此外，遞送dsRNA 的方式也對(duì)致死效果存在一定的影響，如通過(guò)殼聚糖形式向埃及伊蚊（Aedes aegypti）遞送dsSnf7，其死亡率為46.67%，而通過(guò)碳量子點(diǎn)納米技術(shù)向埃及伊蚊遞送dsSnf7的死亡率可達(dá)53.33%［25］。

圖6 注射dsNlSnf7后的蛋白表達(dá)情況Fig.6 The protein expression level after injection dsNlSnf7

本文利用的RNAi 技術(shù)實(shí)施方式主要是注射法和飼喂法，其中注射法雖會(huì)對(duì)蟲(chóng)體造成一定的機(jī)械傷害，但有定量導(dǎo)入dsRNA 和實(shí)驗(yàn)周期短的優(yōu)點(diǎn)，可用于高通量初篩。飼喂法雖實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，但基本不會(huì)造成機(jī)械損傷，可以模擬田間褐飛虱的取食模式，更好地統(tǒng)計(jì)死亡率。通過(guò)注射法和飼喂法確定dsNlSnf7 片段為高效致死的RNAi 靶標(biāo)分子后，本文進(jìn)一步在非目標(biāo)生物中對(duì)其進(jìn)行了安全性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。研究結(jié)果顯示在非目標(biāo)生物中注射dsRNA 后無(wú)RNAi 現(xiàn)象，這與已有研究結(jié)果一致［18，26］，說(shuō)明dsNlSnf7 片段的安全性很高。綜上所述，dsNlSnf7片段是個(gè)安全高效的褐飛虱防治分子靶標(biāo)，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。