黃巧娟，何波，趙鑫，王文濤

（1. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510275；2. 中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510120）

溶酶體相關(guān)膜蛋白（lysosome-associated membrane protein， LAMP）是溶酶體膜蛋白的主要組成部分，約占所有溶酶體膜蛋白的50%［1］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的LAMP 家族成員有：LAMP-1/CD107a、

LAMP-2/ CD107b、 LAMP-3/CD208/DC-LAMP、LAMP-4/CD68/Macrosialin 和LAMP-5/BAD-LAMP，它們共同由一個(gè)約200 個(gè)氨基酸的LAMP 結(jié)構(gòu)域和幾個(gè)N-糖基化位點(diǎn)以及O-糖基化位點(diǎn)組成［2］。LAMP4 又稱(chēng)GP110、SCARD1，更為熟知的名字是CD68，定位于17q13。LAMP4 在人的單核吞噬細(xì)胞系中高表達(dá)，包括單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、破骨細(xì)胞和髓樣樹(shù)突細(xì)胞等，是巨噬細(xì)胞特異的表面分子標(biāo)記物［3］。此外，在其他淋巴細(xì)胞系、巨核細(xì)胞、惡性造血細(xì)胞及非造血細(xì)胞系，包括臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞、纖維母細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和多種腫瘤細(xì)胞中，LAMP4 亦有表達(dá)［4］。大多數(shù)的研究認(rèn)為，在未活化的巨噬細(xì)胞中，LAMP4 定位于內(nèi)膜系統(tǒng)，但在細(xì)胞表面也可以檢測(cè)到少部分的LAMP4［5］。經(jīng)炎癥刺激，LAMP4 蛋白將在細(xì)胞表面大量富集，表明LAMP4 可能參與吞噬作用、細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與病原體間的相互作用［5］。LAMP4 在多種癌癥中差異表達(dá)，被廣泛應(yīng)用于癌癥的診斷與預(yù)后研究。例如，高表達(dá)的LAMP4 可指示霍奇金淋巴瘤的獨(dú)立預(yù)后［6］； 在肺癌和卵巢癌中，LAMP4 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)［7］；在鼻咽癌和結(jié)腸癌中，LAMP4 則對(duì)患者的總生存期起到積極的作用［8］。迄今為止，LAMP4 在炎癥反應(yīng)和致癌作用中的研究還不清晰。從這些分析可以看出，LAMP4 不僅僅是一個(gè)巨噬細(xì)胞細(xì)胞的表面標(biāo)志物，還存在于各種癌癥的發(fā)生過(guò)程中，但是，其作用方式和分子機(jī)制尚不清楚。此外，LAMP4 在不同類(lèi)型白血病中的表達(dá)以及功能如何尚未見(jiàn)有報(bào)道。

目前認(rèn)為，除了急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia，APL）類(lèi)型外，急性髓系白血病是較難治的惡性癌癥之一［9-10］。主要是因?yàn)榧毙运柘蛋籽⊥嬖诙喾N不同類(lèi)型的基因突變、基因表達(dá)水平的變化和基因的轉(zhuǎn)錄修飾，造成了靶向治療的復(fù)雜性；而且，這些遺傳學(xué)異常通過(guò)干擾造血干細(xì)胞的正常增殖、分化和凋亡的過(guò)程導(dǎo)致治療困難，對(duì)預(yù)后造成很大的影響［10-11］。在急性髓系白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）的診斷與分類(lèi)中，染色體異位、倒位、重復(fù)和缺失經(jīng)常與AML 中特定的亞型相聯(lián)系［10，12-13］。AML 中最常見(jiàn)的4 種染色體核型改變是t（8；21），t（15；17），inv（16）和11q23 重排，分 別 產(chǎn) 生 了RUNX1-ETO［14］、PML-RARα［10］和CBFβ-MYH11［10，15］融合基因，以及引起MLL 融合基因［16］，從而導(dǎo)致了不同亞型的急性髓系白血病。因此，深入研究急性髓系白血病發(fā)生機(jī)制及治療靶點(diǎn)仍是重要課題。

本文以急性髓細(xì)胞性白血病為研究材料，檢測(cè)分析了LAMP4 在臨床標(biāo)本以及細(xì)胞性中的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上研究了其在細(xì)胞調(diào)亡及分化方面的功能，同時(shí)研究了AML 分化過(guò)程中，LAMP4 的溶酶體定位動(dòng)態(tài)變化現(xiàn)象，以期為白血病的臨床診斷提供新的分子標(biāo)記和治療靶點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 白血病細(xì)胞系及培養(yǎng)條件

本論文采用的細(xì)胞系：HEK-293T，THP1，NB4，HL60，Molm13，MV4； 11，Jurkat，CEM，RS4； 11 和SUP-B15。細(xì)胞均購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所。HEK-293T 培養(yǎng)在伴有φ=10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中；其他細(xì)胞培養(yǎng)在伴有φ=10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃，φ=5%CO2。

1.2 寡核苷酸及電轉(zhuǎn)體系

本論文中用到的siRNA 及其相應(yīng)的陰性對(duì)照（si-NC）均購(gòu)自蘇州吉瑪制藥技術(shù)有限公司。si-LAMP4-1 正向序列：CGUCACAGUUCAUCCAACATT； si-LAMP4-1 反 向 序 列 ： UGUUGGAUGAACUGUGACGTT。si-LAMP4-2 正向序列：CCCAGAUUCAGAUUCGAGUTT； si-LAMP4-2 反向序列：ACUCGAAUCUGAAUCUGGGTT。si-NC正向序列：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT；si-NC反向序列：ACGUGACACGUUCGGAGAATT。電轉(zhuǎn)采用Invitrogen 公司的neon 電轉(zhuǎn)儀。電轉(zhuǎn)條件為，每10 μL 體系0.1 nmol 的siRNA， 并在1 350 V，10 ms，4 plus條件下進(jìn)行。

1.3 RNA提取及實(shí)時(shí)定量PCR

本研究采用Trizol 試劑（Invitrogen，美國(guó)）提取RNA。提取方法參照Trizol試劑盒提取方案。取400 ng 的總RNA，采用Takara 公司的PrimeScriptTMRT 試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為37 ℃20 min，85 ℃5 s。合成的cDNA 稀釋一倍，保存于-20 ℃。隨后，采用Takara 公司的SYBR? Green Mix 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)條件：①95 ℃預(yù)變性30 s；②95 ℃反應(yīng)10 s；③60 ℃采集熒光，30 s。其中，②和③進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)定量PCR 采用Applied Biosystems 進(jìn)行相對(duì)定量。GAPDH mRNA作為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)采用2-△△CT的方法計(jì)算。

1.4 蛋白收集及Western Blot檢測(cè)蛋白水平

本論文采用RIPA 裂解液（碧云天生物科技有限公司，中國(guó)）裂解細(xì)胞和收集蛋白。在蛋白裂解過(guò)程中，加入蛋白酶抑制劑PMSF，并置于冰上裂解30 min，中間吸吹幾次，使蛋白充分裂解；隨后，15 000 r/min，4 ℃，離心10 min，挑去粘稠狀的核酸； 將上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入5×loading buffer，95 ℃變性10 min；－20 ℃保存待用。Western Blot 流程采用上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗，孵育二抗，加入反應(yīng)底物，然后顯影的方法。GAPDH為內(nèi)參蛋白。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

本研究采用Annexin V-FITC 試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司，中國(guó)）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。首 先，利 用0.25 μmol/L ATO 處 理 轉(zhuǎn) 入siRNA 的THP1 細(xì)胞24 h；隨后，收集細(xì)胞懸液，并按照凋亡試劑盒的方法進(jìn)行染色，最終采用BD FACSCalibur儀器檢測(cè)凋亡率。

1.6 細(xì)胞分化檢測(cè)

本研究首先將轉(zhuǎn)入siRNA 小分子的THP1 細(xì)胞37 ℃培養(yǎng)48 h，加入10 ng/mL PMA 處理72 h；然后，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，1 000 r/min，3 min，棄上清，PBS 洗一次；30～50 μL PBS 重懸細(xì)胞，加入3 μL CD11b （ebioscience， 美國(guó)）及φ=0.5% 的小牛血清封閉液，37 ℃水浴15 min，上機(jī)前離心，并稀釋后置于冰上。最終采用BD FACSCalibur 儀器檢測(cè)分化情況。

1.7 免疫熒光檢測(cè)LAMP4細(xì)胞中定位

本研究取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞（或經(jīng)PMA 處理后的細(xì)胞），1 000 r/min，3 min 收集細(xì)胞，PBS 洗兩次；固定：用φ=4%多聚甲醛（PA）重懸細(xì)胞，將固定液涂在載玻片上，每片50～100 μL，室溫自然晾干；通透：待細(xì)胞懸液晾干后，1 mL PBS 洗3次，每次5 min，φ=1%Triton（PBS 稀釋?zhuān)┩ㄍ?～15 min；封閉：PBS洗3次，每次5 min，φ=5%BSA封閉30 min；一抗采用LAMP1（溶酶體標(biāo)志物），LAMP4，PDI（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志物）結(jié)合：用免疫熒光一抗稀釋液按適宜比例稀釋一抗，室溫孵育4 h 或4 ℃過(guò)夜；二抗結(jié)合：PBS 洗3 次，每次5 min。按合適比例稀釋二抗，室溫孵育1 h；封片：在細(xì)胞表面滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片，封片；保存：4 ℃保存。最終采用蔡司（ZEISS）LSM800 共聚焦顯微鏡檢測(cè)。

1. 8 統(tǒng)計(jì)方法

本論文，所有統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算均采用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行。所有的兩組樣本的比較均采用t檢驗(yàn)，多組樣品間的比較采用方差分析（analysis of variance，ANOVA），組內(nèi)采用Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05 被認(rèn)為具有顯著差異。利用受試者工作特征（Receiver Operating Characteristic， ROC） 曲線研究白血病臨床診斷的意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP4在急性髓細(xì)胞性白血病中的表達(dá)

為了研究LAMP4 在急性髓系細(xì)胞白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）中表達(dá)情況，我們首先對(duì)GES13204［17］數(shù)據(jù)的2 096 個(gè)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，相比較非AML（Non-AML）樣品（n=1 554），LAMP4 在AML 樣品（n=542） 中 特 異 性 高 表 達(dá) （圖1A）（t-test，P＜0.001）。這意味著，LAMP4 可能在AML 中發(fā)揮著潛在功能。于此同時(shí)，我們收集了十種細(xì)胞系的RNA 樣 品， AML： THP1， MV4-11， Molm13，HL60 和NB4； ALL： Jurkat， RS4-11， sup-B15和CEM；以及293T 細(xì)胞系。在這些細(xì)胞系中檢測(cè)LAMP4 的表達(dá)量。如圖1B 所示，LAMP4 在AML 細(xì)胞系中表達(dá)量均顯著高于非AML 細(xì)胞系，這個(gè)結(jié)果與GES13204 樣品檢查是一致的。這些結(jié)果表明，LAMP4 在AML 細(xì)胞中高表達(dá)，可作為潛在的分子標(biāo)志物。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們利用ROC 曲線對(duì)GES13204 數(shù)據(jù)的2 096 個(gè)樣品數(shù)據(jù)中的LAMP4 表達(dá)水平進(jìn)行了分子診斷評(píng)估。結(jié)果顯示， LAMP4 mRNA 區(qū)分AML 和非AML 的AUC為AUC：0.747 0（P ＜0.001，95% CI： 0.723 ～0.771），截?cái)帱c(diǎn)（cutoff）為0.356 2，其中，敏感性為72.88%，特異性為64.09%。這些結(jié)果預(yù)示著，LAMP4 mRNA 具有潛在區(qū)分AML 和非AML能力。

2.2 LAMP4在髓性白血病細(xì)胞系中的功能分析

2.2.1 在細(xì)胞中干擾LAMP4 的效率檢測(cè)分析 急性髓性白血病是一種造血系統(tǒng)的疾病，以造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞異常的增殖、凋亡抑制和分化受阻為特征［10］，我們下面主要從凋亡和分化幾個(gè)方面研究了LAMP4 在AML 中的功能。前期的研究表明，LAMP4 是一個(gè)巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)志物［18］；但是，我們的結(jié)果顯示，LAMP4 在AML 細(xì)胞高表達(dá)，這一結(jié)果提示，LAMP4 不僅僅是一個(gè)標(biāo)志物，可能作為一個(gè)癌基因參與AML的調(diào)控。

圖1 LAMP4在AML中高表達(dá)是潛在的標(biāo)志物Fig.1 Highly expressed LAMP4 could be a potential biomarker for AML

為了研究LAMP4 在AML 細(xì)胞中功能，我們運(yùn)用了RNA 干擾（RNA interfering， RNAi）的方法，設(shè)計(jì)與LAMP4 mRNA 序列同源的雙鏈RNA（double-stranded RNA， dsRNA），dsRNA 特異性的核酸酶Dicer 將dsRNA 裂解成由21～25 個(gè)核苷酸組成的小干擾RNA （small interfering RNA， siRNA），然后siRNA 作為特異性地降解相同序列的LAMP4 mRNA， 從而阻斷LAMP4 的表達(dá)（siRNA 序列見(jiàn)材料與方法部分）。為驗(yàn)證LAMP4 在THP1 中的敲低效果，我們用電轉(zhuǎn)染的方法將小分子siRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)入了AML細(xì)胞系THP4細(xì)胞中，同時(shí)轉(zhuǎn)入了與目的基因無(wú)同源性的siRNA 作為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)細(xì)胞48 h 后，收細(xì)胞提取RNA 和蛋白質(zhì)，分別用實(shí)時(shí)熒光定量和Western Blot 檢測(cè)LAMP4 mRNA水平和蛋白水平上的敲低效率。結(jié)果顯示，兩種siRNA 均對(duì)LAMP4 具有很好的敲低效果，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 THP1細(xì)胞中LAMP4 mRNA和蛋白水平的的敲低效率Fig. 2 mRNA and protein level knockdown efficiency of LAMP1 in THP1

2.2.2 LAMP4調(diào)控AML 細(xì)胞凋亡 我們進(jìn)一步利用上述的siRNA 檢測(cè)了LAMP4 對(duì)THP1 細(xì)胞凋亡的影響。用小分子siRNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法將LAMP4的siRNA 轉(zhuǎn)入THP1 細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)48 h，加入三氧化二砷（arsenic trioxide， ATO） 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡， ATO 是一種常用的促凋亡藥物［19］。我們使用了0.25 μmol/L 的ATO 誘導(dǎo)THP1 凋亡，加藥處理24 h 后，收細(xì)胞用Annexin V-FITC 凋亡試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖3，LAMP4 顯著促進(jìn)THP1的凋亡。

圖3 LAMP4調(diào)控AML細(xì)胞凋亡Fig. 3 LAMP4 regulated the apoptosis of AML cells

2.2.3 LAMP4 調(diào) 控PMA 誘 導(dǎo) 的AML 細(xì) 胞 分 化 急性髓系白血?。ˋML）是一種高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)疾病，分化阻滯是其主要特征之一。通過(guò)藥物誘導(dǎo)分化，白血病細(xì)胞的形態(tài)及生理特征等可向正常細(xì)胞方向轉(zhuǎn)變，從而使疾病得到治療。佛波酯（PMA）是PKC 通路激活劑，與細(xì)胞的增殖、分化和凋亡密切相關(guān)，在髓系白血病細(xì)胞THP1 中，PMA 可以打破細(xì)胞終端分化的阻滯，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，分化成貼壁的巨噬細(xì)胞表型［20-21］，PMA 可能是AML 治療的有效分化誘導(dǎo)劑，但其中具體的機(jī)制還不清楚。首先用10 ng/mL 的PMA 分別誘導(dǎo)THP1 細(xì)胞24、48 和72 h，從細(xì)胞的大小與貼壁性能等特征確定了THP1 細(xì)胞已向巨噬細(xì)胞方向分化（圖4A）；同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)也發(fā)現(xiàn)髓系分化標(biāo)志物CD11b 在PMA 誘導(dǎo)72 h 后明顯高表達(dá)（圖4B）。值得注意的，LAMP4作為一個(gè)巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)量在THP1 細(xì)胞巨噬化的過(guò)程中，隨著時(shí)間的推移，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；而且與PMA 的濃度沒(méi)有顯著關(guān)系，這引起了我們的興趣（圖4C）。這個(gè)結(jié)果進(jìn)一步暗示，LAMP4 不僅僅是一個(gè)巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，還可能是AML 細(xì)胞的分化過(guò)程中的癌基因。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，我們?cè)?0 ng/mL PMA 誘導(dǎo)的THP1細(xì)胞的情況下，同時(shí)敲低LAMP4，檢測(cè)LAMP4 調(diào)控AML的分化能力。結(jié)果顯示，在敲低LAMP4的THP1細(xì)胞中，髓系分化標(biāo)志物CD11b 表達(dá)水平明顯升高（圖4D），這證實(shí)LAMP4 作為癌基因參與AML 的分化調(diào)控，可能是AML細(xì)胞分化抑制的重要分子。

2.3 LAMP4參與溶酶體調(diào)控通路

前期的研究表達(dá)，LAMP 家族的其他成員LAMP1，LAMP2 廣泛定位于溶酶體中，并調(diào)控細(xì)胞的代謝，凋亡和分化過(guò)程。為了進(jìn)一步探討LAMP4 調(diào)控AML 細(xì)胞凋亡和分化的分子機(jī)制，我們利用免疫熒光的技術(shù)，探討LAMP4的定位情況。根據(jù)免疫熒光的結(jié)果，LAMP4 在細(xì)胞內(nèi)主要定位于溶酶體，而部分定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（圖5A）。那么，作為巨噬細(xì)胞表面分子標(biāo)記，在PMA 誘導(dǎo)THP1 巨噬化的過(guò)程中，LAMP4 的定位是否會(huì)發(fā)生改變呢？我們分別用低質(zhì)量濃度和高質(zhì)量濃度的PMA 處理THP1細(xì)胞，即10 ng/mL的PMA 誘導(dǎo)24 h和10 ng/mL 的PMA 誘導(dǎo)72 h，然后用免疫熒光的方法檢測(cè)LAMP4 在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在短時(shí)間誘導(dǎo)的情況下，LAMP4 的定位并沒(méi)有發(fā)生改變，仍然主要定位于溶酶體（圖5B）；但是，在72 h 誘導(dǎo)的情況下，LAMP4 顯著的從溶酶體中剝離（圖5C）。前期的研究表達(dá)，溶酶體能夠通過(guò)多種途徑調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡和細(xì)胞代謝［1，22］。這一結(jié)果說(shuō)明，LAMP4 有可能通過(guò)溶酶體發(fā)揮調(diào)控AML 細(xì)胞的分化阻滯和凋亡抑制功能，其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

圖4 LAMP4調(diào)控AML細(xì)胞分化Fig.4 Impact of LAMP4 on AML differentiation

圖5 免疫熒光檢測(cè)LAMP4與亞細(xì)胞定位Fig.5 Immunofluorescence assay showing the subcellular localization of LAMP4

3 討 論

溶酶體是細(xì)胞質(zhì)中重要的細(xì)胞器，參與細(xì)胞的代謝、免疫、自噬等生理過(guò)程，與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［22］。LAMP4 被報(bào)道在不同腫瘤發(fā)生過(guò)程中表達(dá)異常［4，18］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)LAMP4 在AML 白血病中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)LAMP4 對(duì)AML 的發(fā)生起到抑制作用，功能初步研究表明，LAMP4 影響急性髓系白血病的分化和細(xì)胞凋亡過(guò)程。

溶酶體相關(guān)膜蛋白是位于溶酶體上的高糖基化的跨膜蛋白，LAMP 家族的五個(gè)成員結(jié)構(gòu)類(lèi)似［1］；那么功能是否也參與了相似的途徑，均參與溶酶體自噬相關(guān)的通路。我們前期報(bào)道的蛋白LAMP5也同樣定位于溶酶體-自噬上，是一個(gè)自噬抑制分子［12］。而本文中發(fā)現(xiàn)的LAMP4 也定位于溶酶體上，當(dāng)PMA 誘導(dǎo)后，LAMP4 剝離于溶酶體，說(shuō)明LAMP4也有可能是溶酶體-自噬過(guò)程的抑制分子，與LAMP5 有同樣的功能。此外，溶酶體是細(xì)胞自噬過(guò)程中重要的細(xì)胞器，在某些條件下，自噬和凋亡之間可以相互促進(jìn)［23］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，敲低LAMP4 調(diào)控AML 細(xì)胞凋亡與LAMP5 的功能一致。所以，家族成員LAMP4 與LAMP5 在溶酶體上可能具有相似的功能，這對(duì)于LAMP4 功能的深入研究具有借鑒作用。

目前研究發(fā)現(xiàn)，LAMP4 的高表達(dá)可作為霍奇金淋巴瘤的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)記［6］。在乳腺癌中，CD68陽(yáng)性細(xì)胞與人表皮生長(zhǎng)因子受體-2（human epidermal growth factor receptor 2， HER2）、腫瘤直徑、TNM 分期正相關(guān)［7］。LAMP4 在胃癌組織中高表達(dá)，而且與胃癌的腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期密切相關(guān)［24］。CD68 陽(yáng)性細(xì)胞的食管鱗狀細(xì)胞癌患者總生存期較長(zhǎng)，而且是該病患者早期診斷、預(yù)后及預(yù)測(cè)淋巴管及血管轉(zhuǎn)移的分子指標(biāo)之一［18］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，LAMP4 在急性髓系白血病中特異性高表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)其可做為潛在區(qū)分AML 與非AML 的標(biāo)志物。這些結(jié)果說(shuō)明，LAMP4 可能是惡性癌癥的廣泛標(biāo)志物。

前期的研究普遍表明，LAMP4 作為一個(gè)巨噬細(xì)胞標(biāo)志物在PMA 誘導(dǎo)THP1巨噬化過(guò)程中，呈現(xiàn)高表達(dá)［21］。我們的研究卻表明，在短期PMA 誘導(dǎo)過(guò)程中，LAMP4 呈現(xiàn)高表達(dá)；但是在長(zhǎng)期PMA 誘導(dǎo)分化過(guò)程中，其呈現(xiàn)低表達(dá)。這說(shuō)明，LAMP4可能在癌癥轉(zhuǎn)變的不同時(shí)期，扮演者不同的功能。例如，在肺癌和卵巢癌中，CD68 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)密度與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)［7］，鼻咽癌和結(jié)腸癌中，CD68則對(duì)患者的總生存期起到積極的作用［8］。我們的研究也表明，在長(zhǎng)時(shí)間PMA 誘導(dǎo)的情況下，敲低LAMP4 后，AML 的分化更強(qiáng)，這一結(jié)果也表明，LAMP4 的癌性功能［5］。我們推測(cè)LAMP4 可能在癌癥發(fā)展的不同階段扮演者不同的功能，這一進(jìn)程與AML 細(xì)胞的形成與分化息息相關(guān)。在AML分化早期，過(guò)多的LAMP4 蛋白可能誘發(fā)過(guò)量的細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子對(duì)AML 的發(fā)展不利；但是到分化后期，LAMP4 低表達(dá)維持分化末期AML 的細(xì)胞因子水平；但如果進(jìn)一步下調(diào)LAMP4，將會(huì)破壞AML細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)一步導(dǎo)致分化和死亡。

溶酶體被認(rèn)為復(fù)雜的信號(hào)中心，控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、分裂和分化。例如，雷帕霉素復(fù)合體1激酶的主要調(diào)控靶點(diǎn)在溶酶體上被激活，以響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子的輸入，同時(shí)調(diào)控相關(guān)組織的成長(zhǎng)和分化。溶酶體也使自噬成為可能，這是一種“自食”過(guò)程，對(duì)質(zhì)量控制和應(yīng)激適應(yīng)至關(guān)重要。溶酶體生長(zhǎng)和分解代謝方案的錯(cuò)誤執(zhí)行導(dǎo)致各種癌癥的發(fā)生，其中包括AML［2，22］。LAMP1 和LAMP2是溶酶體重要組成蛋白［1-2］，是溶酶體調(diào)控生命活動(dòng)的重要組成部分，幾乎參與多種類(lèi)型的細(xì)胞活化和分化的進(jìn)程中［1］。本研究發(fā)現(xiàn)，在AML 細(xì)胞中LAMP4 主要存在于溶酶體上，說(shuō)明LAMP4 可能也參與溶酶體的相關(guān)功能調(diào)控。在PMA 長(zhǎng)期誘導(dǎo)的情況下，LAMP4 從溶酶體上剝離下來(lái)。這些表明，LAMP4 可能通過(guò)溶酶體信號(hào)通路調(diào)控AML 的分化及形成。

總之，我們的研究表明LAMP4 在AML 中高表達(dá)，并參與AML 細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化過(guò)程。我們還首次揭示LAMP4 主要定位于溶酶體上，在佛波酯的誘導(dǎo)下，LAMP4 能夠從溶酶體上脫落下來(lái)，初步證明LAMP4 抑制細(xì)胞分化的癌性功能與溶酶體定位相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)表明LAMP4 可為AML 潛在的臨床診斷分子標(biāo)記物，并且是一個(gè)AML 治療的潛在靶點(diǎn)。