王彥平 張保朝 溫昌明 聞公靈 路海娟

南陽市中心醫(yī)院，河南 南陽 473000

腦外傷可造成腦組織局灶性或廣泛性損傷，常引起不同程度永久性功能障礙，可表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知、理解、記憶、信息處理等功能受損，發(fā)生率和致殘率較高，嚴(yán)重威脅人類身心健康，影響患者生存質(zhì)量，因此，積極預(yù)防和處理顱腦創(chuàng)傷后繼發(fā)神經(jīng)損傷是臨床治療顱腦創(chuàng)傷的基本原則[1-2]。顱腦損傷可繼發(fā)一系列病理生理改變，海馬是大腦重要區(qū)域之一，與記憶、認(rèn)知、神經(jīng)等功能密切相關(guān)，海馬萎縮或海馬內(nèi)神經(jīng)元脫失是引起認(rèn)知、精神障礙的主要原因，而顱腦創(chuàng)傷可導(dǎo)致海馬內(nèi)神經(jīng)元發(fā)生不同程度損傷，影響其神經(jīng)電生理功能。為避免神經(jīng)功能紊亂，細(xì)胞會進(jìn)行代償性自我保護(hù)、避免細(xì)胞凋亡及抗細(xì)胞損傷等變化，但海馬自我修復(fù)能力常不足以彌補(bǔ)外傷造成的損傷，且顱腦損傷后機(jī)體各種應(yīng)激反應(yīng)會被激活，過度應(yīng)激反而會加重海馬組織細(xì)胞凋亡，因此需要及時采取有效干預(yù)措施進(jìn)行治療[3-4]。紅景天為多年生草本植物，其藥用價值最早在《四部醫(yī)典》《本草綱目》中均有記載，其中紅景天苷(salidroside，Sal)是紅景天主要有效成分之一，研究發(fā)現(xiàn)Sal可通過干細(xì)胞代謝、改變細(xì)胞膜性質(zhì)等抑制腫瘤細(xì)胞增殖，通過提高T淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率和吞噬細(xì)胞活力增強(qiáng)免疫力[5]，還具有抗心臟損傷作用[6]、抗氧化[7]、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞[8]等作用。

c-Jun氨基末端激酶3/半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(JNK3/caspase-3)信號通路屬于絲裂原激活酶蛋白激酶(mitogen-activate protein kinase，MAPK)通路，可參與細(xì)胞生長、增殖及分化、凋亡等多種生物過程。研究證實(shí)，細(xì)胞應(yīng)激及損傷與JNK3相關(guān)通路激活密切相關(guān)，JNK3主要表達(dá)于大腦及睪丸中，創(chuàng)傷性腦外傷等應(yīng)激條件下可導(dǎo)致JNK3激活，通過參與細(xì)胞凋亡與早期腦損傷神經(jīng)組織損傷，進(jìn)而使下游蛋白Jun磷酸化啟動凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的表達(dá)和釋放，caspase-3是凋亡信號級聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵蛋白[9-10]。目前關(guān)于Sal減輕腦外傷是否與JNK3/caspase-3信號通路有關(guān)，尚鮮有報道。因此，本實(shí)驗通過改良Feeney法制備腦外傷大鼠模型，擬探究Sal對腦外傷大鼠海馬神經(jīng)元損傷及JNK3/caspase-3信號通路的影響，以期揭示其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗動物6周齡雄性SD大鼠50只，體質(zhì)量180～200 g[貨號：101-SD(CD)大鼠SPF級]，購自北京維通利華實(shí)驗動物公司。飼養(yǎng)條件：溫度(23±2)℃，濕度(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由飲水飲食環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究經(jīng)本院動物實(shí)驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2主要儀器及試劑紅景天苷(Sal，貨號：DH0037)，純度≥98%，購自成都德斯特生物科技有限公司。尼氏染色試劑盒(Nissol Stain，甲基紫法)(貨號：YM-S1652)購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Click-iTTMTUNEL Colorimetric IHC Detection Kit(貨號：C10625)、鼠源一抗caspase-3抗體(貨號：MA1-91637)、JNK3抗體(貨號：MA5-31795)、GAPDH抗體(貨號：AM4300)、兔源p-JNK3抗體(貨號：PA5-40275)、二抗羊抗鼠IgG(貨號：B-2752)，羊抗兔IgG(貨號：A32731)均購自美國Invitrogen。超氧化物歧化物(superoxide dismutase，SOD)測定試劑盒(貨號：k335-100)購自艾美捷科技生物有限公司；丙二醛(malondialdehyde，MAD)測定試劑盒(貨號：A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所。奧林巴斯IX75光學(xué)顯微鏡(日本)、MODEL550型酶標(biāo)儀(美國，Bio-Rad公司)等。

1.3方法

1.3.1 建模與分組：參照改良Feeney法制備腦外傷大鼠模型[11]，隨機(jī)選取34只SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉麻醉后，沿其顱頂正中線切開頭皮，以冠狀縫旁1.5 mm及矢狀縫旁2.5 mm處為原點(diǎn)，電動磨鉆鉆約5 mm×5 mm骨窗，并于骨窗正中安置撞墊，將40 g砝碼從25 cm高處沿落體引導(dǎo)管墜落至顱腦損傷，止血沖洗后，骨蠟封閉，縫合頭皮。其中死亡2只，造模成功32只。隨機(jī)取24只造模成功SD大鼠，分別采用Sal 50 mg/kg(Sal低劑量組)、100 mg/kg(Sal中劑量組)、200 mg/kg(Sal高劑量組)灌胃，每組8只，取剩下8只為模型組。假手術(shù)組操作步驟同造模但不予以顱腦打擊；正常對照組為正常飼養(yǎng)SD大鼠。假手術(shù)組、模型組、正常對照組均予以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)給藥12周。

1.3.2 標(biāo)本采集：灌胃12周末，10%水合氯醛腹腔麻醉處死，打開胸腔，暴露心臟，4%多聚甲醛灌注，斷頭取腦內(nèi)海馬組織，脫水、石蠟包埋，以4m厚度切片。另取適量海馬組織進(jìn)行均漿，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 觀察海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)：石蠟標(biāo)本切片規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化采用Nissl染色，焦油紫染色液于37 ℃恒溫孵育1 h，950 mL/L酒精分化，無水乙醇脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察形態(tài)并采集圖像。

1.3.4 檢測海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡：石蠟標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟水化后，于流水中反復(fù)沖洗，3%過氧化氫室溫孵育10 min，TBS洗滌后行原位末端標(biāo)記法(TUNEL)染色，顯色后滴加蘇木素復(fù)染，梯度乙醇充分脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞數(shù)，計算海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 檢測海馬組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MAD水平：采用定量檢測試劑盒測定各組大鼠海馬組織勻漿標(biāo)本SOD、MAD水平，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.6 檢測海馬組織p-JNK3/JNK3、caspase-3蛋白表達(dá)：采用蛋白抽提試劑盒提取各組大鼠海馬組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，置于—80 ℃保存?zhèn)溆?。蛋白樣品?0 V電壓下6% SDS-PAGE電泳，250 mA下PVDF膜轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，添加JNK3(稀釋比1∶1 000)、p-JNK3(稀釋比1∶1 000)、caspase-3(稀釋比1∶200)、GAPDH(稀釋比1∶500)抗體4 ℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜 3 次，15 min/次，含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗IgG(稀釋比1∶5 000)室溫孵育 1 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結(jié)果并拍照分析各蛋白條帶灰度值，分別以靶蛋白灰度值與內(nèi)參GAPDH條帶比值、p-JNK3/JNK3為目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1海馬神經(jīng)元形態(tài)正常對照組與假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，層次豐富，包膜完整。模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞萎縮，排列稀疏，層次減少。Sal低、中、高劑量組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較模型組依次明顯改善。見圖1。

注：A：正常對照組；B：假手術(shù)組；C：模型組；D：Sal低劑量組；E：Sal中劑量組；F：Sal高劑量組圖1 海馬組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)(Nissl染色，×100)Figure 1 Morphology of neurons in hippocampus(Nissl dyeing，×100)

2.2各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，Sal低、中、高劑量組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率依次降低(P<0.05)。見表1。

2.3各組大鼠海馬組織中MDA含量及SOD活性比較與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織中MDA含量顯著增加(P<0.05)，SOD活性降低(P<0.05)；與模型組比較，Sal低、中、高劑量組大鼠海馬組織中MDA含量依次降低(P<0.05)，SOD活性依次升高(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況比較

表2 各組大鼠海馬MDA含量及SOD活性比較Table 2 Comparison of MDA content and SOD activity inhippocampus of rats in each

2.4各組大鼠海馬組織p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，Sal低、中、高劑量組大鼠海馬組織p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白水平依次降低(P<0.05)。見圖2、表3。

注：a：正常對照組；b：假手術(shù)組；c：模型組；d：Sal低劑量組；e：Sal中劑量組；f：Sal高劑量組圖2 WB檢測p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)Figure 2 The expression of p-JNK3/JNK3 and cleaved-caspase-3 was detected by WB

表3 各組大鼠海馬組織p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平比較Table 3 Comparison of p-JNK3/JNK3 and cleaved-caspase-3 protein expression levels in hippocampus of rats in

3 討論

紅景天苷是傳統(tǒng)中藥紅景天主要活化成分之一，常用于緩解高原反應(yīng)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)Sal具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)細(xì)胞損傷等多種生物活性。SHATI等[12]研究報道，Sal可抑制高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病大鼠腎組織系膜增生、腎纖維化、腎細(xì)胞凋亡及caspase-3蛋白表達(dá)。REN等[13]研究報道，Sal可通過結(jié)合并抑制絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(MEK)活性，呈劑量依賴性降低MAPK信號通路ERK及下游磷酸化蛋白水平，抑制肺癌A549細(xì)胞增殖，減小裸鼠荷瘤腫瘤體積。CONCERTO等[8]研究報道，Sal可調(diào)節(jié)人體神經(jīng)可塑性，防止神經(jīng)元突觸的活性依賴降低，紅景天提取物的適應(yīng)和抗抑郁作用可能是基于其對大腦可塑性的調(diào)節(jié)作用。本研究發(fā)現(xiàn)，正常對照組與假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，層次豐富，包膜完整；模型組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞萎縮，排列稀疏，層次減少，提示腦外傷造成大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞損傷，提示造模成功。Sal低、中、高劑量組大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較模型組明顯改善，提示Sal可呈劑量依賴性減輕腦外傷SD大鼠海馬神經(jīng)元組織損傷。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、MDA含量顯著增加，SOD活性降低；與模型組比較，Sal低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、MDA含量依次降低，SOD活性依次升高。原因可能為腦外傷引起血管破裂后痙攣可造成腦組織缺血缺氧，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞等釋放各種炎性因子及氧自由基，加重腦損傷，造成海馬及大腦皮質(zhì)等組織神經(jīng)元凋亡，而Sal在此過程中可能發(fā)揮抗炎作用[14-15]。腦外傷可導(dǎo)致SD大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡，Sal可呈劑量依賴性保護(hù)其免受凋亡。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡與JNK/caspase-3信號通路激活密切相關(guān)[16]。

JNK屬于MAPK家族，主要包括JNK1、JNK2、JUN3，是一類胞內(nèi)具有絲氨酸/蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的蛋白激酶，可參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種過程，與細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)，其中JNK3主要存在于大腦及睪丸組織，與神經(jīng)炎癥、損傷等密切相關(guān)[17-20]。YU等[21]研究報道，姜黃素可通過抑制JNK/c-Jun信號通路，下調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤的作用。ZHANG等[22]研究報道，迷迭香酸通過抑制Akt/JNK3/caspase-3信號通路保護(hù)大鼠海馬神經(jīng)元免受腦缺血/再灌注損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對照組、假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬組織p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白水平顯著增加；與模型組比較，Sal低、中、高劑量組p-JNK3/JNK3、cleaved-caspase-3蛋白水平依次降低。磷酸化的JNK3蛋白處于活化狀態(tài)可激活caspase-3，促使cleaved-caspase-3活性形式表達(dá)及釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示Sal可能通過抑制p-JNK活化抑制JNK3/caspase-3信號通路，保護(hù)腦外傷SD大鼠海馬神經(jīng)元組織免受氧化應(yīng)激損傷及凋亡。

紅景天苷可減輕腦外傷大鼠海馬神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，抑制其細(xì)胞凋亡，可能與抑制JNK3/caspase-3信號通路有關(guān)，可能對腦外傷后海馬神經(jīng)元損傷研究提供新的思路。但神經(jīng)元損傷可能涉及多種通路共同調(diào)控，關(guān)于Sal對腦外傷后海馬神經(jīng)元損傷保護(hù)的具體作用機(jī)制尚有待后期進(jìn)一步深入研究。