郝小花 戴佳利 暨文勁 黃丹 李東屏 田連福

（1.湖南文理學(xué)院生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，常德 415000；2.湖南師范大學(xué)作物生命科學(xué)學(xué)院 作物不育資源創(chuàng)新與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410081）

由于工業(yè)化的發(fā)展和化肥的施用，耕地普遍存在鎘（Cd）污染問題。水稻屬于易吸收和積累Cd的作物，在Cd污染稻田中種植水稻會導(dǎo)致大米Cd超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。全世界約有一半的人口以稻米為主食，長期食用Cd超標(biāo)的大米，對人體健康產(chǎn)生不利影響。培育籽粒Cd低積累的水稻品種是防止大米Cd超標(biāo)的有效辦法之一。

近年來，隨著分子生物學(xué)、測序技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)植物在重金屬解毒和重金屬耐受方面的研究取得較大進(jìn)展。植物進(jìn)化出各種機(jī)制來維持必需金屬離子的生理濃度［1-3］，同時最大限度地減少植物體內(nèi)過多重金屬離子對植物細(xì)胞造成的損害，從而賦予植株對重金屬脅迫的耐受性。當(dāng)植物暴露于達(dá)到毒害作用的重金屬濃度時，首先通過限制重金屬離子進(jìn)入外質(zhì)體、將它們與細(xì)胞壁或細(xì)胞滲出物結(jié)合、降低根細(xì)胞對重金屬離子的吸收，或通過抑制長距離運(yùn)輸把重金屬阻隔在地下組織中［4-6］。其次，已進(jìn)入細(xì)胞的重金屬離子，可以通過一系列的存儲和解毒策略緩解，包括離子運(yùn)輸、螯合或隔離到液泡中［7］。最后，植物還可以通過激活氧化應(yīng)激防御機(jī)制和與應(yīng)激相關(guān)的蛋白質(zhì)和信號分子等激活不同的防御或抵抗途徑來進(jìn)行防御，如熱休克蛋白、激素和活性氧等［8-9］。水稻中已經(jīng)鑒定出一些與Cd轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒等相關(guān)的基因，包括OsNRAMP1［10］、OsNRAMP2［11］、OsNRAMP3［12］、OsNRAMP5［13］、OsNRAMP6［14］、OsHMA2［15］、OsHMA3［16］、OsHMA9［17］、OsIRT1［18］、OsIRT2［19］、OsZIP1［20］、LCD［21］、OsLCT1［22］、OsPCR1［23］、O s C C X 2［24］、O s A B C G 4 3［25］、O s C A L 1［26］、OsPCS1［27］、OsPCS2［28］、OsPCS15［29］、OsMTP1［30］等，它們在水稻中，參與Cd的解毒、吸收、運(yùn)輸和分配。

水稻LCD是一個沒有同源基因的單基因。該基因突變導(dǎo)致水稻籽粒中Cd含量大幅降低［21］。lcd突變體在植物早期發(fā)育過程中，無論是在平板中還是在水培液中都表現(xiàn)出對Cd的耐受性。Cd含量測定表明，突變體植株的地上部分的Cd含量比野生型顯著降低。在Cd污染的土壤中進(jìn)行田間培養(yǎng)，突變體葉片的Cd含量與野生型差異不顯著，但籽粒中Cd含量顯著降低。lcd突變體與野生型植株的生物量和種子產(chǎn)量無顯著差異。LCD定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，主要在根系的維管組織和葉片的韌皮部伴胞細(xì)胞中表達(dá)［31］，可能參與調(diào)控Cd的長距離運(yùn)輸。敲除該基因可以限制Cd向地上部，尤其是籽粒的運(yùn)輸，從而降低籽粒中Cd的含量。蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示，OsLCD蛋白沒有富含半胱氨酸，不具有重金屬解毒功能，同時也不包含跨膜結(jié)構(gòu)域，沒有轉(zhuǎn)運(yùn)功能，推測LCD蛋白可能通過與其他蛋白相互作用來調(diào)節(jié)水稻體內(nèi)Cd的積累和運(yùn)輸。

酵母雙雜交（Yeast two hybrid）是一種有效的篩選和鑒定蛋白相互作用的分子生物技術(shù)［31-33］，在解析蛋白作用的分子機(jī)制研究中有廣泛的應(yīng)用。傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)僅限于核蛋白的互作分析，不能進(jìn)行膜蛋白互作的研究。Stagljar等［34］發(fā)展了基于分裂泛素（Split-ubiquitin）的酵母雙雜交系統(tǒng)，克服了傳統(tǒng)酵母雙雜交系統(tǒng)的局限性。DUALmembrane系統(tǒng)是基于分裂泛素介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，可以進(jìn)行膜蛋白-膜蛋白、膜蛋白-可溶性蛋白間的互作研究。DUALmembrane膜體系酵母雙雜交文庫系統(tǒng)已應(yīng)用在水稻條紋葉枯病毒的傳播機(jī)制的研究和擬南芥纖維素合成相關(guān)蛋白互作的研究中［35-36］。

水稻LCD影響籽粒Cd累積，但其作用的分子機(jī)制尚不清晰。本研究擬通過酵母雙雜交技術(shù)篩選和鑒定與LCD互作的蛋白（調(diào)控蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），為闡明LCD參與的Cd離子轉(zhuǎn)運(yùn)、積累的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為挖掘遺傳新資源、培育低鎘水稻新品種提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻品種為粳稻日本晴（Oryza sativa ssp.japonica cv.Nipponbare）；引物、培養(yǎng)基、常規(guī)化學(xué)試劑等訂購于上海生工生物工程有限公司，RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄酶、X-α-gal、AbA、高保真酶、限制性內(nèi)切酶等購自Invitrogen公司。

膜體系酵母雙雜交系統(tǒng)為Biotech公司DUALmembrane system，酵母菌株為NMY51，文庫載體為pPR3-N，誘餌載體為pBT3-N，陽性對照載體為pOst-Nub1。

核體系酵母雙雜交系統(tǒng)為Clontech公司Yeast Two-Hybrid System，酵母菌株為AH109，文庫載體為pADKT7，誘餌載體為pGBKT7，陽性對照載體為pGBKT7-53和pGADT7-T，陰性對照載體為pGBKT7-Lam。

以日本晴生長一周的根、地上部分，分蘗期的根、葉，開花期的根、葉、節(jié)、節(jié)間、花均量混勻?yàn)椴牧?，分別構(gòu)建DUALmembrane系統(tǒng)和Yeast Two-Hybrid系統(tǒng)cDNA文庫，文庫構(gòu)建由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

質(zhì)粒擴(kuò)繁在大腸桿菌Top10中進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 水稻LCD誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù)水稻LCD序列設(shè)計(jì)特異性引物，以cDNA文庫為模板，擴(kuò)增LCD編碼區(qū)序列，經(jīng)純化后，與T載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化，并提取陽性菌落的質(zhì)粒。依據(jù)LCD的序列和誘餌載體（pBT3-N、pGBKT7）的多克隆位點(diǎn)，選擇合適的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)構(gòu)建誘餌載體的引物（表1）。對pMD18-T-LCD和誘餌載體進(jìn)行酶切、純化，用T4連接酶連接過夜，轉(zhuǎn)化，篩選陽性克隆，提取陽性質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測序驗(yàn)證獲得正確的誘餌載體。

表1 構(gòu)建誘餌載體的引物序列

1.2.2 重組載體轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 將酵母菌種（NMY51、AH109）在YPDA平板上劃線，30℃倒置培養(yǎng)3 d左右，挑取單克隆酵母于50 mLYPDA培養(yǎng)基中，30℃，230-250 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；測定OD546=0.6-0.8；2 500 r/min離心5 min收集菌體；每個反應(yīng)管加1.5 μg誘餌質(zhì)粒，300 μL PEG/LiOAc master Mix（50%PEG 2.4 mL、1 mol/L LiOAc 360 μL和Single-stranded carrier DNA 250 μL），輕輕渦旋混勻，100 μL重懸細(xì)胞，渦旋1 min至各組分充分混勻；42℃水浴孵育45 min；500×g 離心5 min，棄上清，用150 μL NaCl（0.9%）溶液重懸菌體；涂不同的營養(yǎng)缺陷平板，30℃倒置培養(yǎng)3-5 d。

1.2.3 文庫載體插入片段的擴(kuò)增和測序 應(yīng)用文庫載體的通用引物（表2），對篩選出的陽性酵母中水稻cDNA文庫載體（pPR3-N、pGADT7）的插入片段進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為10×buffer 2 μL、dNTP各0.2 mmol/L、上下游引物各1 μL（10 μmol/L）、Taq 0.5 μL，補(bǔ)充ddH2O至20 μL。PCR產(chǎn)物純化后送到上海生工生物公司測序。得到的序列在NCBI中用BLAST程序比對查找同源序列并確認(rèn)基因。

表2 擴(kuò)增文庫載體插入片段的引物序列

2 結(jié)果

2.1 DUALmembrane酵母雙雜交系統(tǒng)（膜系統(tǒng)）篩選與LCD互作的蛋白

2.1.1 誘餌蛋白LCD自激活及膜系統(tǒng)酵母篩庫體系檢測 根據(jù)膜系統(tǒng)酵母雙雜交的載體選擇原則，選擇pBT3-N作為誘餌蛋白表達(dá)載體進(jìn)行篩庫，誘餌蛋白載體為pBT3-N-LCD。按照表3載體組合檢測誘餌蛋白載體pBT3-N-LCD的自激活。結(jié)果（圖1）表明，轉(zhuǎn)化1的酵母菌可以在SD-Leu平板上正常生長，說明pBT3-N-LCD表達(dá)的融合蛋白對NMY51酵母細(xì)胞的生長無毒性；轉(zhuǎn)化組合2在SD-Lue-Trp、SD-Lue-Trp-His和SD-Lue-Trp-His-Ade平板上均可以生長，說明pBT3-N-LCD和pOst-Nub1表達(dá)的融合蛋白可以相互結(jié)合并激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，表明篩庫系統(tǒng)可以正常工作；轉(zhuǎn)化組合3在SD-Lue-Trp平板上可以正常生長，在SD-Lue-Trp-His平板上少量生長，在SD-Lue-Trp-His-Ade平板上完全不能生長（圖1），說明pBT3-N-LCD和pPR3-N表達(dá)的融合蛋白不存在自激活作用。根據(jù)酵母生長結(jié)果，選擇SD-Lue-Trp-His-Ade平板作為后續(xù)篩選互作蛋白的篩選條件。

2.1.2 膜系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母克隆篩選 將水稻膜系統(tǒng)文庫質(zhì)粒和pBT3-N-LCD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母NMY51，共標(biāo)記得到354個陽性克隆。將354個菌落劃線至SD-Lue-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上，發(fā)現(xiàn)共有284個菌落呈藍(lán)色，說明pBT3-N-LCD與284個蛋白可能存在互作，并激活下游報(bào)告基因的表達(dá)，不能生長和不能變藍(lán)的菌落視為假陽性，予以舍棄。將第二輪篩選出來的生長良好并呈現(xiàn)藍(lán)色的酵母克隆，再次在SD-Lue-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上篩選（圖2），仍然生長良好并呈現(xiàn)藍(lán)色的酵母菌落有228個。通過二、三輪的劃線篩選，最終篩選出228個潛在的陽性菌落。

表3 DUALmembrane系統(tǒng)誘餌蛋白LCD自激活體系

圖1 誘餌蛋白LCD在酵母NMY51中的自激活檢測

圖2 LCD互作的陽性酵母顯色篩選

2.1.3 膜系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母克隆插入片段的獲得與鑒定通過對228個陽性克隆菌落（依次編號為1-228）擴(kuò)增，得到198個文庫質(zhì)粒pPR3-N中的插入cDNA片段。將198個PCR片段進(jìn)行測序，去除重復(fù)序列，共得到120個測序結(jié)果。將測序結(jié)果BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gow/BLAST/）進(jìn)行基因相似性比較，查找同源基因。進(jìn)一步去除同源基因中讀碼框與pPR3-N插入片段讀碼框不一致的基因，最終共得到22個UniGene（表4）。通過功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，2、11、12、13、19、20與植物耐逆和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)；1、3、4、7與植物發(fā)育響應(yīng)有關(guān)；14、15、16、17、18與細(xì)胞的生理代謝有關(guān)等。其中11號OsMTP1已有報(bào)道，與水稻Cd的積累和耐受性有關(guān)。

2.1.4 LCD與膜系統(tǒng)篩選出的22個候選蛋白的互作驗(yàn)證將篩選到的22個基因克隆，構(gòu)建重組載體pPR3-N-1-22，并按照表5的轉(zhuǎn)化組合進(jìn)行自激活檢測發(fā)現(xiàn)，22個基因中編號15（LOC_Os01g38970）不僅可以在SD-Lue-Trp平板上生長，而且可以在SD-Lue-Trp-His-Ade平板上生長，說明LOC_Os01g38970在酵母中存在自激活現(xiàn)象，考慮其互作可能是假陽性，予以舍棄。選擇其余的21個基因進(jìn)行互作驗(yàn)證。

將pBT3-N-LCD分別與pPR3-N-1-22（15除外）共同轉(zhuǎn)化酵母NMY51，進(jìn)行一對一互作初步驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，16不能在SD-Leu-Trp-His-Ade上生長，其余20個均可在SD-Leu-Trp-His-Ade平板上長出大量白色酵母菌落，說明這20個蛋白在酵母中與LCD存在互作，16舍棄。進(jìn)一步將20個在SDLeu-Trp-His-Ade平板上長出的白色酵母菌落轉(zhuǎn)移至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal+AbA平板上（圖3），發(fā)現(xiàn)共16個酵母菌斑可以很好的生長并呈現(xiàn)藍(lán)色，說明這16個蛋白與誘餌蛋白LCD之間存在互作，8、17、18、22不能生長或變藍(lán)予以舍棄。最終得到與LCD的互作蛋白為LOC_Os01g67250、LOC_Os10g34614、LOC_Os07g39900、LOC_Os08g01780、LOC_Os02g35560、LOC_Os06g45120、LOC_Os03g38020、LOC_Os08g42050、LOC_Os12g32380、LOC_Os05g03780、LOC_Os07g44180、LOC_Os09g30418、LOC_Os01g69220、LOC_Os06g08170、LOC_Os11g25980和LOC_Os08g44280，共16個。

表4 候選蛋白的功能分析

表5 膜系統(tǒng)篩選出的候選互作蛋白的自激活檢測

2.2 核系統(tǒng)酵母雙雜交篩選與LCD互作的蛋白

2.2.1 核系統(tǒng)條件下誘餌蛋白自激活檢測 將重組質(zhì)粒pGBKT7-LCD轉(zhuǎn)化酵母AH109，并以轉(zhuǎn)化空載體pGBKT7的AH109作為對照，涂布在SDTrp和SD-Trp-His平板上。結(jié)果（圖4）表明，轉(zhuǎn)化pGBKT7和pGBKT7-LCD的酵母都能在SD-Trp的平板上正常生長，說明pGBKT7-LCD表達(dá)的融合蛋白對AH109酵母細(xì)胞的生長無毒性。且轉(zhuǎn)化pGBKT7和pGBKT7-LCD的酵母都不能在SD-Trp-His平板上生長。同時，將pGBKT7-LCD和pGADT7共轉(zhuǎn)化酵母AH109，涂布于SD-Trp-Leu和SD-Trp-Leu-His平板上，結(jié)果表明，酵母可以在SD-Trp-Leu平板上生長，但不能在SD-Trp-Leu-His平板上生長。綜合轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果，說明pGBKT7-LCD表達(dá)的融合蛋白不具有激活報(bào)告基因（His）的作用，可用于后續(xù)篩庫。

圖3 LCD與候選蛋白在膜系統(tǒng)酵母中的互作驗(yàn)證

圖4 核系統(tǒng)條件下誘餌蛋白LCD在酵母AH109中的自激活檢測

2.2.2 pGADT7-prey和pGBKT7-LCD的共轉(zhuǎn)化和互作蛋白篩選將pGADT7-prey和pGBKT7-LCD共轉(zhuǎn)化酵母AH109，涂布于SD-Trp-Leu-His-Ade平板上，共標(biāo)記51個陽性克隆。將51個菌落劃線至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal平板上（圖5）發(fā)現(xiàn)，共有43個菌落呈藍(lán)色，說明LCD與43個蛋白在酵母中互作，不能生長和不能變藍(lán)的菌落視為沒有互作，予以舍棄。

2.2.3 陽性AH109酵母菌中pGADT7插入片段的獲得和分析通過對2次篩選出的43個陽性菌落擴(kuò)增，得到38個文庫質(zhì)粒pGADT7中插入的cDNA片段，5個菌落經(jīng)多次擴(kuò)增都不能擴(kuò)增出片段，予以舍棄。將擴(kuò)增出的38個PCR片段進(jìn)行測序，去除重復(fù)序列，共得到25序列，將得到的25個測序結(jié)果利用NCBI在線比對工具BLAST（http：//www，ncbi.nlm.nih.gow/BLAST/）逐一進(jìn)行基因相似性比較，查找同源基因，去除同源基因讀碼框與pGADT7插入片段的讀碼框不一致的序列，最終共得到7個UniGene（表6），編號為1-7。其中，5、6、7與植物抗逆和物質(zhì)的運(yùn)輸有關(guān)；2、3、4與細(xì)胞生理代謝相關(guān)。

圖5 核系統(tǒng)條件下LCD互作的陽性酵母顯色篩選

表6 核體系下篩選的LCD候選互作蛋白

2.2.4 AH109酵母中LCD與互作蛋白的驗(yàn)證 克隆篩選到的7個基因CDS全長序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGADT7-1-7，并按照2.1的方法進(jìn)行自激活檢測。發(fā)現(xiàn)1、4基因存在自激活現(xiàn)象，予以舍棄，2、3、5、6和7不存在自激活現(xiàn)象，可以進(jìn)一步進(jìn)行互作驗(yàn)證。

將pGBKT7-LCD分別與pGADT7-2、pGADT7-3、pGADT7-5、pGADT7-6、pGADT7-7共同轉(zhuǎn)化酵母AH109，發(fā)現(xiàn)2、3、5、6、7均可以在SD-Leu-Trp-His-Ade長出白色酵母菌落，說明2、3、5、6、7與LCD在酵母中存在互作。進(jìn)一步將在SD-Leu-Trp-His-Ade營養(yǎng)缺陷板上長出的白色酵母菌落轉(zhuǎn)移至SD-Leu-Trp-His-Ade+X-α-gal板，發(fā)現(xiàn)5個編號的轉(zhuǎn)化菌株均能生長并呈現(xiàn)藍(lán)色（圖6）。因此，最終篩選得到的互作蛋白為LOC_Os03g15570、LOC_Os12g08760、LOC_Os 12g18110、LOC_Os 05g45950和LOC_Os 02g33820。

圖6 LCD與候選蛋白在AH109酵母中的互作驗(yàn)證

3 討論

近年來，已經(jīng)有20多個介導(dǎo)水稻Cd積累的相關(guān)基因被鑒定，除LCD之外，大多數(shù)基因都直接參與Cd的吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)過程，主要是一些轉(zhuǎn)運(yùn)Fe、Mn、Zn、Ca等離子的運(yùn)輸?shù)鞍祝鏝ramp5介導(dǎo)水稻Mn/Cd的吸收［37］；OsHMA3在根部細(xì)胞的液泡膜上，把Zn/Cd轉(zhuǎn)運(yùn)到液泡中解毒，維持水稻中Zn的穩(wěn)態(tài)［16，38］；OsCCX2在水稻節(jié)部調(diào)節(jié)Ca/Cd的分配［24］。除了運(yùn)輸?shù)鞍?，一些富含半胱氨酸的蛋白或多肽，能螯合Cd和解Cd等重金屬毒害，如植物螯合肽（PC）及其谷胱甘肽（GSH）等前體、金屬硫蛋白（MT）等。這些蛋白和多肽的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，對水稻對Cd的分配以及Cd毒害耐性有重要影響，如OsLCT1很可能能轉(zhuǎn)運(yùn)PC的前體，調(diào)控水稻GSH穩(wěn)態(tài)，在As/Cd解毒中起重要作用［22］。防衛(wèi)素蛋白如CAL1等也富含半胱氨酸，能螯合胞質(zhì)中的Cd并分泌到木薄壁細(xì)胞外，促進(jìn)Cd通過導(dǎo)管從根部到葉片的長距離運(yùn)輸［26］。此外，還有一些調(diào)控基因如轉(zhuǎn)錄因子、miRNA等，在調(diào)控水稻吸收、運(yùn)輸、分配Cd的過程中起作用，最終影響Cd在水稻不同部位的分配和積累［39］。而LCD定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，既不是離子運(yùn)輸?shù)鞍祝膊皇歉缓腚装彼岬牡鞍?，也沒有典型的結(jié)構(gòu)域，推測LCD可能通過與其他蛋白互作，調(diào)控某個（或某些）Cd轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但目前對其介導(dǎo)Cd轉(zhuǎn)運(yùn)的機(jī)制還不清晰。

本研究以水稻一周的根、地上部分，分蘗期的根、葉，開花期的根、葉、節(jié)、節(jié)間、花均量混勻?yàn)椴牧?，分別構(gòu)建DUALmembrane系統(tǒng)和Yeast Two-Hybrid系統(tǒng)cDNA文庫，并以LCD為誘餌，初步篩選到了21個與其互作的重要蛋白，分別屬于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、逆境響應(yīng)相關(guān)蛋白、生長發(fā)育相關(guān)蛋白、蛋白激酶、生理代謝相關(guān)等及一些未知功能蛋白。與LCD互作的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中，有MTP、MFS（Metal facilitator superfamily）等轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，如LOC_Os05g03780、LOC_Os06g08170、LOC_Os08g42050等，推測水稻受到Cd毒害之后，LCD可能通過與相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相互作用，調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，從而影響Cd在水稻中的分配和積累。其中，LOC_Os05g03780（OsMTP1）已經(jīng)被報(bào)道參與Cd的運(yùn)輸。OsMTP1屬于陽離子擴(kuò)散促進(jìn)劑（CDF）蛋白家族，廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物和動物體內(nèi)。在酵母或煙草中異源表達(dá)OsMTP1能夠增強(qiáng)Cd積累和對Cd的耐受性。dsRNAi水稻轉(zhuǎn)基因幼苗對重金屬敏感性改變，同時成熟水稻不同器官中金屬的積累量也發(fā)生了變化［30，40］。最近，一個MFS成員OsCd1已被鑒定，參與水稻Cd吸收與籽粒Cd積累［40］。LCD互作蛋白中，LOC_Os06g08170是一個MFS新成員，其是否參與水稻的Cd吸收與轉(zhuǎn)運(yùn)有待進(jìn)一步的研究。

蛋白激酶、熱激蛋白、ABA相關(guān)蛋白等在植物生物與非生物逆境脅迫反應(yīng)中都起著重要的作用，如Cd能通過誘導(dǎo)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，激活2個玉米蛋白激酶（ZmMPK3和ZmMPK6），來響應(yīng)Cd脅迫［41］。早前也有研究發(fā)現(xiàn)水稻的這兩個蛋白激酶（OsMPK3和OsMPK6）受Cd誘導(dǎo)激活，且該激活需要鈣依賴的蛋白激酶（CDPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3kinase）的參與，增強(qiáng)植物的耐Cd能力［42］。另外的研究發(fā)現(xiàn)，異源表達(dá)一個水稻熱激蛋白（OsMSR3），能夠增加擬南芥耐Cd、Cu毒害的能力［43-44］。與LCD互作的蛋白中，也有蛋白激酶（LOC_Os03g38020和LOC_Os03g15570）、熱激蛋白（LOC_Os09g30418）等，其與LCD相互作用的具體機(jī)制還需進(jìn)行深入研究。

由于酵母雙雜存在一定的局限性，本研究獲得的互作蛋白還是一個初步結(jié)果，下一步還需采用其他方法，對初篩出的21個蛋白作進(jìn)一步互作分析，如利用雙分子熒光互補(bǔ)、免疫共沉淀等方法對LCD和21個候選蛋白之間的互作進(jìn)行鑒定。此外，還需要構(gòu)建基因敲除突變體等遺傳材料，對候選互作蛋白在Cd積累中的遺傳功能開展研究，多方面探討LCD參與的Cd離子轉(zhuǎn)運(yùn)、積累機(jī)制。

4 結(jié)論

利用水稻膜系統(tǒng)和核系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫，篩選和鑒定了21個與LCD相互作用的蛋白，參與植物對逆境響應(yīng)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等途徑，推測LCD與其中某些蛋白共同作用調(diào)節(jié)水稻Cd積累。