劉國(guó)濤，張樹(shù)宇，魏 凱*

（1.山東省濱州市畜牧獸醫(yī)管理服務(wù)中心，山東 濱州 256600； 2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安）

酵母雙雜交系統(tǒng)是研究活細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的一種強(qiáng)大且常用的分子生物學(xué)技術(shù)。該技術(shù)不僅能夠檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的蛋白互作，而且可以檢測(cè)微弱的或者瞬時(shí)的蛋白相互作用。實(shí)驗(yàn)方法具有成本低，易操作，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單等一系列優(yōu)點(diǎn)，在生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用十分廣泛。酵母雙雜交技術(shù)在眾多生物學(xué)相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛且前景廣闊。本文對(duì)酵母雙雜交技術(shù)的基本原理、應(yīng)用、發(fā)展前景等方面進(jìn)行綜述。

蛋白質(zhì)在生命活動(dòng)的的許多過(guò)程發(fā)揮著不可或缺的作用，如細(xì)胞間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，胞內(nèi)物質(zhì)的代謝及細(xì)菌病毒對(duì)細(xì)胞的入侵等。研究蛋白質(zhì)相互作用對(duì)于人們深入了解預(yù)防傳染病，靶向治療多基因疾病有重要意義。酵母雙雜交技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單及其對(duì)微弱或短暫蛋白互作的檢測(cè)能力使其在互作蛋白篩選過(guò)程中得到廣泛應(yīng)用。

1 酵母雙雜交技術(shù)的基本原理

1986年Keegan等[1]發(fā)現(xiàn)了酵母細(xì)胞中的Gal4結(jié)構(gòu)可結(jié)合特定的DNA序列（上游激活域，UAS），從而在半乳糖存在的情況下激活轉(zhuǎn)錄。1989年，F(xiàn)ields和Song通過(guò)描述一種基因系統(tǒng)來(lái)檢測(cè)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，徹底改變了蛋白質(zhì)相互作用分析[2]。Gal4有兩個(gè)不同功能域即：N端DNA結(jié)合域（DNA-BD）和C端（轉(zhuǎn)錄）激活域（AD），兩個(gè)單獨(dú)的域均獨(dú)立于另一個(gè)而維持其功能。在誘餌蛋白上加上BD結(jié)構(gòu)域，在獵物蛋白上加上AD結(jié)構(gòu)域，當(dāng)誘餌和獵物結(jié)合時(shí)，BD和AD結(jié)構(gòu)域在空間上相互接近，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用。DNA-BD結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合GAL上的UAS（上游激活序列），AD結(jié)構(gòu)域激活基因轉(zhuǎn)錄，從而使酵母特定基因如LzcZ、HIS3、MEL1、ABAr的表達(dá)，使酵母菌能夠在特定的營(yíng)養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)水解培養(yǎng)基上的X-α-Gal[2]，使無(wú)色透明的X-α-Gal分解從而使菌落產(chǎn)生藍(lán)斑，降低了假陽(yáng)性率；也可通過(guò)AbA抗生素篩選報(bào)告基因的表達(dá)而在抗生素培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，提高了準(zhǔn)確性。

2 酵母雙雜交技術(shù)的應(yīng)用

2.1 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選互作蛋白

從cDNA文庫(kù)中尋找與已知蛋白相互作用的未知蛋白是酵母雙雜交技術(shù)最為重要的用途[3]。孫杰等[4]利用酵母雙雜交統(tǒng)從人胚胎肝臟cDNA文庫(kù)中篩選到三個(gè)與JNKK2相互作用的蛋白，為深入探究JNKK2在肝臟中的作用奠定了基礎(chǔ)。Zhao等[5]通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)篩選和鑒定與環(huán)狀泰勒蟲(chóng)半胱氨酸蛋白酶（TaCP）相互作用的宿主蛋白CRBN和Ppp4C，與CRBN和Ppp4C的相互作用表明TaCP可能參與調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和細(xì)胞增殖，這有助于了解環(huán)線蟲(chóng)與宿主細(xì)胞之間 的相互作用。Rana等[6]通過(guò)酵母雙雜對(duì)人腦cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，確定了7種宿主蛋白（CCDC130、CPNE6、POLR2C、MAPK9、EIF4A2、EIF1A1和EIF3I）作為CHIKV nsP2的假定相互作用子，為更深入的研究提供了基礎(chǔ)。

2.2 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)繪制蛋白質(zhì)相互作用圖譜

進(jìn)入新的世紀(jì)，生命科學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)成為了當(dāng)前研究重點(diǎn)，繪制蛋白質(zhì)互作圖譜對(duì)研究生命活動(dòng)調(diào)控有十分重要意義[7]。Xiang等[8]繪制了脊髓灰質(zhì)炎病毒P3蛋白的完整蛋白連鎖圖，研究聚合酶3Dpol與VPg和3AB的遺傳變異的相互作用。Teutschbein等[9]繪制結(jié)核分枝桿菌ESAT-6分泌系統(tǒng)1（ESX-1）的蛋白質(zhì)連鎖圖，研究各種蛋白質(zhì)之間的相互作用，以此作為藥物開(kāi)發(fā)的序幕。

2.3 通過(guò)酵母雙雜交技術(shù)篩選藥物靶標(biāo)

在過(guò)去的30多年里，酵母雙雜交系統(tǒng)已經(jīng)有了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用，在藥物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用。Lai等[10]利用酵母雙雜交技術(shù)鑒定與弓形蟲(chóng)SAG1相互作用的宿主蛋白，發(fā)現(xiàn)富含賴氨酸的智人螺旋卷曲蛋白與SAG1相互作用，該蛋白可以作為疫苗研究中的潛在藥物靶標(biāo)。Pfefferle等[11]利用酵母雙雜技術(shù)篩選鑒定免疫菌素（PPIA、PPIB、PPIH、PPIG、FKBP1A、FKBP1B）作為CoV非結(jié)構(gòu)蛋白1（Nsp1）的相互作用伴侶，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢菌素A（CspA）對(duì)親環(huán)蛋白的抑制作用會(huì)阻止所有屬CoV的復(fù)制，包括SARS-CoV，人CoV-229E和-NL-63，貓CoV以及禽類傳染性支氣管炎病毒。CspA的非免疫抑制衍生物可作為廣泛的CoV抑制劑，應(yīng)用于人和動(dòng)物的CoV。

3 酵母雙雜交優(yōu)勢(shì)及該技術(shù)存在的缺點(diǎn)

酵母雙雜交系統(tǒng)已被證明是一種有用且靈敏高效的方法，不僅可以檢測(cè)胞內(nèi)穩(wěn)定的相互作用蛋白，還可以檢測(cè)微弱和短暫的蛋白相互作用。由于它也相對(duì)容易實(shí)現(xiàn)且價(jià)格便宜，因此酵母雙雜交系統(tǒng)迅速成為檢測(cè)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的首選系統(tǒng)。

3.1 酵母雙雜交篩選互作蛋白的優(yōu)勢(shì)

以往的蛋白互作研究技術(shù)均是進(jìn)行的體外實(shí)驗(yàn)，如免疫共沉淀、交聯(lián)、親和層析等，這些實(shí)驗(yàn)方法受外界因素干擾較大，且可能會(huì)和一些在空間上本不可能接觸的蛋白互作，酵母雙雜交技術(shù)因?yàn)槭窃诨罴?xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，不受外界因素影響，同時(shí)也對(duì)瞬時(shí)存在的和不穩(wěn)定的蛋白有較好的檢測(cè)效果。

3.2 酵母雙雜交技術(shù)存在的缺陷

酵母雙雜交系統(tǒng)簡(jiǎn)單、易操作、多樣性及高通量的能力使其成為最受歡迎的蛋白質(zhì)互作分析篩選方法，但所有的酵母雙雜交方法都存在假陽(yáng)性和假陰性問(wèn)題。（1）假陽(yáng)性：某些誘餌蛋白或獵物蛋白具有激活轉(zhuǎn)錄的功能，獵物-BD融合基因與誘餌-AD融合基因無(wú)需相互接觸就能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，發(fā)生自激活現(xiàn)象從而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。此外，一些蛋白可能會(huì)與其他蛋白形成蛋白復(fù)合體，激活報(bào)告基因，使酵母雙雜產(chǎn)生假陽(yáng)性。免疫共沉淀（CO-IP）和pull-down技術(shù)也用來(lái)驗(yàn)證酵母雙雜的篩選出來(lái)的互作蛋白，經(jīng)過(guò)這三種技術(shù)篩選出來(lái)的互作蛋白才有可能是目的蛋白。（2）假陰性：在酵母菌株中表達(dá)的蛋白質(zhì)可能有毒性，從而抑制酵母的生長(zhǎng)或其報(bào)告基因的表達(dá)。為了抑制背景表達(dá)而在培養(yǎng)基中添加的氨基三唑[12]（3-AT，3-Aminotriazole）也會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生一定毒性，一些較弱的蛋白質(zhì)互作可能會(huì)被掩蓋。此外，融合的酵母表達(dá)蛋白可能會(huì)引起空間位阻，從而阻礙蛋白相互作用，導(dǎo)致假陰性。

4 酵母雙雜交技術(shù)的發(fā)展

4.1 基于膜系統(tǒng)的酵母雙雜交（Membranebasedyeasttwo-hybridsystem）

在真核細(xì)胞中，很多蛋白質(zhì)都是膜相關(guān)蛋白質(zhì)，由于其疏水特性及不位于核內(nèi)，因此經(jīng)典的酵母雙雜交系統(tǒng)很難用于檢測(cè)蛋白互作。1998年Stagljar等[13]開(kāi)發(fā)出了基于分裂泛素的遺傳系統(tǒng)，用于分析體內(nèi)膜蛋白之間的相互作用。膜酵母雙雜交系統(tǒng)利用基于對(duì)體內(nèi)重組泛素加工檢測(cè)的泛素分裂法。在X和Y蛋白相互作用時(shí)，泛素重組，使蛋白裂解，釋放轉(zhuǎn)錄因子從而啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，該系統(tǒng)可用來(lái)檢測(cè)膜蛋白間的相互作用。

4.2 酵母雙雜交文庫(kù)的高通量篩選

高通量篩選系統(tǒng)大大提高了文庫(kù)篩選效率。Yachie等[14]設(shè)計(jì)的BFG-Y2H系統(tǒng)利用Cre重組酶通過(guò)條碼標(biāo)記每個(gè)誘餌和獵物基因，通過(guò)高通量測(cè)序同時(shí)識(shí)別所有的相互作用蛋白，此外BFG-Y2H系統(tǒng)還可檢測(cè)自激活誘餌的相互作用。Yu等[15]開(kāi)發(fā)出的新方法可僅使用10ng文庫(kù)并通過(guò)15個(gè)循環(huán)擴(kuò)增后進(jìn)行高通量測(cè)序，較傳統(tǒng)的方法能夠評(píng)估插入的基因數(shù)、基因豐度等指標(biāo)。

5 展望

酵母雙雜交技術(shù)建立30多年以來(lái)，雖然存在假陽(yáng)性、假陰性等缺陷，但仍得到了廣泛的應(yīng)用及相應(yīng)的發(fā)展，酵母單雜（yeast one-hybrid）、酵母三雜（Yeast Three-Hybrid）等技術(shù)也相繼問(wèn)世其快速、高效等特點(diǎn)受到學(xué)界廣泛認(rèn)可，酵母雜交技術(shù)對(duì)生物學(xué)研究及藥物的研發(fā)功不可沒(méi)，必將在今后的研究中發(fā)揮更重要的作用。