劉曉倩 喬 珺 張 蕾 張 新*

由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的乙型肝炎(簡稱乙肝)在世界范圍內(nèi)具有極高的發(fā)病率，我國是乙肝發(fā)病大國，且一直是突出的公共衛(wèi)生問題[1]。干擾素α(interferon alpha，IFN-α)具有抗病毒及抗腫瘤的調(diào)節(jié)作用，在乙肝治療中應(yīng)用較為廣泛[2]。此外有研究發(fā)現(xiàn)，IFN-α的其他機(jī)制也可能具有治療乙肝及肝纖維化的作用。劉娜等[3]研究結(jié)果顯示，IFN-α可通過調(diào)節(jié)免疫提高對乙肝的療效。同時(shí)免疫炎性水平異常也是影響肝纖維化的重要因素，提示IFN-α也可能具有抑制乙肝纖維化的作用[4]。

轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)及活化素A(activins A，ACT-A)均屬于TGF-β超家族，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的作用。有研究顯示，TGF-β1可通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞促進(jìn)肝纖維化，并且TGF-β1可能預(yù)示著更嚴(yán)重的肝組織損傷和纖維化程度[5-6]。ACT-A是一種由性腺分泌的肽類激素，具有調(diào)節(jié)纖維化的作用[7]。本研究主要分析IFN-α對乙肝小鼠肝組織病變及纖維化的影響，并檢測TGF-β1及ACT-A的變化，為將IFN-α更好應(yīng)用于治療乙肝提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇無特定病原體(specific pathogen free，SPF)級(jí)飼養(yǎng)條件下BALB/c雌性小鼠共30只，鼠齡為8周，均購自中國動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(Laboratory Animal Center)；將生理狀況一致的健康30只小鼠分為3組，每組10只，分別為對照組、模型組和IFN-α組。

1.2 儀器與試劑

(1)儀器設(shè)備：采用ARCHITECT i2000SR酶標(biāo)儀(美國雅培公司)；ABI 7500 qPCR檢測系統(tǒng)(美國Life technologies公司)；BX63電動(dòng)熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

(2)試劑：HBV及Hank調(diào)試劑(北京動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)研究中心)；pKCMvint.IFN-α-2a及陰性對照質(zhì)粒pKCMvint(德國埃森醫(yī)院病毒研究所)；血清谷氨酸轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(aspartate transferase，AST)、HBV血清標(biāo)志物HBeAg、HBsAg及IFN-α酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自北京樂博公司；蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin，HE)染色和Masson染色試劑盒均購自武漢華美公司；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒及SYBR Green PCR Master Mix qPCR(定量PCR，quantitative qPCR)試劑盒(瑞士Roche公司)；抗體(美國Abcam公司)；膜聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(美國Bio-Rad公司)。

1.3 干預(yù)方法

模型組和IFN-α組根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]建立HBV感染模型，使用Hank調(diào)試劑將HBV稀釋至1×106個(gè)/ml，然后經(jīng)小鼠尾靜脈注射HBV溶液，注射劑量為10 ml/kg。對照組注射等劑量溶劑。IFN-α組[9]通過高壓尾靜脈注射pKCMvint.IFN-α-2a，每只10 μg，每2周一次，其中模型組注射等劑量的陰性對照。注射后第28 d檢測各指標(biāo)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ELISA檢測

注射后第28 d，采用ELISA檢測AST、ALT、HBeAg、HbsAg、IFN-α、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)及白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)的水平。對小鼠進(jìn)行眼眶取血，利用離心設(shè)備，以6000 r/min的速度離心10 min，收集上層血清，通過磷酸緩沖液將其稀釋20倍后，根據(jù)ELISA試劑盒說明書加入試劑，檢測血清中HBV標(biāo)志物HBeAg、HBsAg及IFN-α水平。

1.4.2 染色

注射后28 d將小鼠麻醉后處死，取出肝組織，室溫固定并包埋。將樣品切成4 μm厚的均勻薄片，進(jìn)行脫蠟及水合，分別通過HE及Masson試劑進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察肝組織形態(tài)和纖維化程度。

1.4.3 RT-qPCR檢測

使用Trizol 試劑獲得肝組織中總核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)，并檢測RNA濃度和純度。使用逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒逆轉(zhuǎn)錄1 μg RNA用于合成cDNA(42 ℃下60 min，70 ℃下5 min，然后4 ℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒和RTqPCR檢測系統(tǒng)。進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)(在95 ℃/10 min，40個(gè)循環(huán)，94 ℃/15 s，60 ℃/1 min，60 ℃/1 min，4 ℃保存)。比較循環(huán)閾值(ΔΔCt)用于分析RNA的表達(dá)。磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)和序列(U6)用于標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4.4 蛋白印跡方法(Western blot)

采用Western Blot檢測肝組織中TGF-β1和ACT-A蛋白水平。在液氮的保護(hù)下裂解肝組織，在12000 rpm，4 ℃下離心15 min收集上清液，使用蛋白檢測方法(bicinchoninic acid，BCA)確定蛋白質(zhì)濃度。十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)(10%)電泳后進(jìn)行PVDF膜轉(zhuǎn)及封閉。加入一抗后在室溫下振蕩2 h，后在4 ℃環(huán)境下孵育過夜，加入二抗。使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS19軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，單因素方差分析(analysis of variance，ANOVA)評估組間差異，計(jì)量資料采用均值標(biāo)準(zhǔn)差()表示，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況比較

對照組小鼠飲食、活動(dòng)及排泄正常，皮毛有光澤且精神狀態(tài)正常。模型組小鼠出現(xiàn)明顯的精神萎靡，活動(dòng)及飲食減少，部分出現(xiàn)腹水。IFN-α組的小鼠飲食和活動(dòng)基本正常，皮毛較柔順，無腹水出現(xiàn)。

2.2 小鼠血清HBV標(biāo)志物及IFN-α水平比較

模型組及IFN-α組小鼠血清中可檢測出明顯的HBV標(biāo)志物HBeAg和HBsAg，并且IFN-α組血清HBeAg和HBsAg水平顯著低于模型組(t=6.132，t=5.986；P＜0.05)。模型組和對照組IFN-α水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，IFN-α組的IFN-α水平顯著高于模型組(t=4.812，P＜0.05)，見表1。

2.3 小鼠肝功能水平比較

模型組小鼠血清肝功能指標(biāo)ALT和AST顯著高于對照組(t=6.115，t=6.548；P＜0.05)，IFN-α組的ALT和AST水平顯著低于對照組(t=4.661，t=5.018；P＜0.05)，見表2。

2.4 小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)變化

對照組小鼠的肝組織中細(xì)胞形態(tài)完整，排列緊密，細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)完整且清晰。模型組小鼠的肝細(xì)胞出現(xiàn)顯著形變，細(xì)胞排列異常，出現(xiàn)假肝小葉，并且出現(xiàn)炎癥反應(yīng)。IFN-α組小鼠的肝組織損傷程度較模型組顯著緩解，炎癥反應(yīng)較輕，細(xì)胞排列基本緊密。各組小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)見圖1。

2.5 小鼠肝組織纖維化情況比較

Masson染色檢測中灰藍(lán)色為纖維組織，結(jié)果顯示對照組小鼠肝組織未發(fā)現(xiàn)明顯的纖維化現(xiàn)象，而模型組小鼠的肝組織出現(xiàn)大量的纖維化染色，IFN-α組小鼠的肝組織基本正常，并且僅有少量的纖維化染色，見圖2。

2.6 小鼠炎性因子比較

模型組小鼠血清TNF-α和IL-6水平顯著高于對照組(t=5.771，t=6.238；P＜0.05)，IFN-α組的TNF-α和IL-6水平顯著低于模型組(t=5.823，t=5.339；P＜0.05)，見表3。

表1 各組小鼠血清HBV標(biāo)志物和IFN-α水平比較()

注：表中IFN-α為干擾素α；HBeAg、HBsAg均為乙肝病毒血清標(biāo)志物

表2 各組小鼠血清ALT和AST水平比較(U/L，)

表2 各組小鼠血清ALT和AST水平比較(U/L，)

注：表中IFN-α為干擾素α；ALT為血清谷氨酸轉(zhuǎn)移酶；AST為門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶

圖1 HE染色檢測各組小鼠肝組織病理學(xué)形態(tài)(×400)

圖2 Masson染色檢測各組小鼠肝組織纖維化情況(×400)

表3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平比較(μg/L，)

表3 各組小鼠血清TNF-α和IL-6水平比較(μg/L，)

注：表中IFN-α為干擾素α；TNF-α為腫瘤壞死因子α；IL-6為白細(xì)胞介素6

表4 各組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平比較()

表4 各組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平比較()

注：表中IFN-α為干擾素α；TGF-β1為轉(zhuǎn)化生長因子β1；ACT-A mRNA為活化素A信使核糖核酸

2.7 小鼠肝組織TGF-β1及ACT-A表達(dá)水平比較

模型組小鼠肝組織中TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平顯著高于對照組(tTGF-β1=5.061，t=5.018；tACT-A=4.718，t=4.059；P＜0.05)，IFN-α組的TGF-β1、ACT-A的mRNA和蛋白水平顯著低于模型組(tTGF-β1=6.224，t=4.389；tACT-A=5.973，t=5.389；P＜0.05)，見表4及圖3。

圖3 各組小鼠肝組織中TGF-β1和ACT-A蛋白水平蛋白印跡電泳圖

3 討論

我國是乙肝發(fā)病大國，該疾病為患者、家庭和社會(huì)帶來了極大的負(fù)面影響。有研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV可持續(xù)的損傷患者肝細(xì)胞，長期可能造成肝纖維化甚至肝硬化。有效清除病毒緩解肝損傷是治療乙肝的重要途徑。

IFN-α最初在60年前被發(fā)現(xiàn)，具有干擾病毒復(fù)制的能力，有研究已證明IFN-α可通過干擾素刺激基因影響HBV生命周期的多個(gè)步驟以抑制HBV復(fù)制[10]。此外，IFN-α還具有免疫調(diào)節(jié)活性，可調(diào)節(jié)對HBV感染的免疫反應(yīng)促進(jìn)HBV的清除[11]。臨床研究已發(fā)現(xiàn)IFN-α可用于治療HBV感染，但仍有部分患者對IFN-α反應(yīng)不佳，在治療48周后，只有20～40%的患者出現(xiàn)HBeAg血清轉(zhuǎn)化，可能與不同的HBV基因型有關(guān)[12]。但也有研究顯示IFN-α具有治療乙肝的作用，并且具有一定的安全性[13]。Li等[14]的研究顯示對基線HBsAg水平較低的乙肝患者在早期使用聚乙二醇-IFN-α-2a治療可能會(huì)在96周后出現(xiàn)HBsAg降低。本研究中，根據(jù)參考文獻(xiàn)[8]通過經(jīng)小鼠尾靜脈注射HBV的方式建立乙肝模型，后根據(jù)參考文獻(xiàn)的常用方法尾靜脈注射pKCMvint.IFN-α-2a質(zhì)粒以提高IFN-α的表達(dá)水平[9]。建模后通過檢測小鼠血清中HBV標(biāo)志物和IFN-α的水平發(fā)現(xiàn)模型組和IFN-α組的HBeAg和HbsAg顯著高于對照組，并且IFN-α組的IFN-α顯著高于模型組，而HBeAg和HbsAg顯著低于對照組。結(jié)合過往研究，本研究結(jié)果顯示了IFN-α對于感染HBV的小鼠具有顯著的抑制病毒復(fù)制的作用。

為進(jìn)一步研究IFN-α對乙肝小鼠肝損傷的影響，進(jìn)一步分析了IFN-α對HBV感染小鼠模型病理形態(tài)學(xué)、血清炎性因子、TGF-β1和ACT-A水平的影響。結(jié)果顯示模型組的肝功能指標(biāo)AST、ALT和炎性因子TNF-α及IL-6顯著高于對照組。IFN-α組的肝功能損傷程度和炎性因子水平顯著低于對照組。對于模型組，HE染色也可觀察到明顯的組織損傷和炎性反應(yīng)，Masson染色可觀察到肝組織纖維化的加重，而IFN-α組的肝組織損傷程度和纖維化程度顯著低于對照組。有臨床研究顯示，IFN-α具有調(diào)節(jié)HPV感染的宮頸癌患者的免疫應(yīng)答和抑制炎性反應(yīng)[15]。劉萍等[16]的研究顯示，腺病毒肺炎嬰幼兒外周血中促炎細(xì)胞因子的水平與IFN-α負(fù)相關(guān)。此外，李學(xué)艷等[17]發(fā)現(xiàn)，IFN-α可有效抑制皰疹性咽峽炎患者的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。而炎性因子也是誘發(fā)肝纖維化和肝硬化的主要因素。HBV感染可通過剪接特異性蛋白促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)并誘發(fā)肝癌的發(fā)生，而控制TGF-β1可延緩乙肝纖維化進(jìn)展[18-19]。ACT-A是TGF-β超家族中的成員，感染引起的炎性反應(yīng)也會(huì)引起ACT-a的升高，但關(guān)于ACT-A在乙肝肝損傷和肝纖維化中的機(jī)制尚不清楚。有研究發(fā)現(xiàn)，控制ACT-A的水平有助于緩解炎性反應(yīng)保護(hù)肝組織[20-21]。

4 結(jié)論

本研究提示IFN-α可控制炎性因子及ACT-A和TGF-β1的水平，緩解肝組織損傷和纖維化。IFN-α不但可抑制HBV的復(fù)制，還可通過控制ACT-A及TGF-β1的表達(dá)緩解炎性反應(yīng)，并減少HBV感染引起的肝組織損傷和纖維化。但關(guān)于IFN-α在乙肝肝纖維化中的作用機(jī)制仍需深入探究。