矯麗曼， 梁泰銘， 紀(jì)純陽(yáng)， 李曉宇， 張 妍

(1.遼寧省楊樹(shù)研究所, 遼寧 蓋州 115213； 2.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院, 遼寧 沈陽(yáng) 110161)

楊樹(shù)爛皮病又稱腐爛病，病原有性階段為污黑腐皮殼ValsasordidaNit.，無(wú)性階段為金黃殼囊孢菌Cytosporachrysosperma(Pers.) Fr.[1-2]。爛皮病是楊樹(shù)的重要枝干病害，是潛伏侵染性病害，當(dāng)出現(xiàn)水澇、干旱、凍害、日灼等惡劣條件，以及苗木移植或強(qiáng)度修剪后不易恢復(fù)樹(shù)木生機(jī)時(shí)，病害便迅速發(fā)生，輕者影響樹(shù)木生長(zhǎng)，出現(xiàn)放葉晚、葉片變小、枯枝、枯干等病狀，重者造成樹(shù)木成片死亡[2-5]。

豚草AmbrosiaartemisiifoliaL.，屬菊科Compositae豚草屬Ambrosia，又名艾葉破布草、美洲艾，一年生草本植物，原產(chǎn)于美國(guó)，20世紀(jì)30年代初傳入我國(guó)東部沿海，現(xiàn)在全國(guó)范圍內(nèi)廣泛分布[6-7]。豚草生長(zhǎng)于荒地、路邊、水溝旁、田塊周?chē)蜣r(nóng)田中，具有生命力強(qiáng)、生長(zhǎng)旺盛、適應(yīng)性廣、種子產(chǎn)量高、耗水量大和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)高等特點(diǎn)，遮蓋和壓抑周?chē)淖魑?，阻礙農(nóng)業(yè)操作，導(dǎo)致作物減產(chǎn)甚至絕收[8]。同時(shí)豚草花粉極易引起過(guò)敏反應(yīng)[7]。許多學(xué)者對(duì)豚草進(jìn)行了各方面的研究，豚草粗提物具有殺蟲(chóng)、抑菌和滅螺等多種生物活性[9-10]。

楊樹(shù)爛皮病傳統(tǒng)的防治方法是將樹(shù)木病灶處用刀劃開(kāi)后涂堿水，效果往往不明顯。用廣譜的抑菌藥劑雖達(dá)到較好抑菌效果，但對(duì)生態(tài)環(huán)境造成污染。本文研究了小葉楊爛皮病的致病性，并進(jìn)行豚草粗提物對(duì)爛皮病及致病病斑抑菌試驗(yàn)，這一研究為植物源農(nóng)藥在林業(yè)病蟲(chóng)害防治中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)[11]。

1 試驗(yàn)材料

1.1 植物材料

小葉楊枝條采自內(nèi)蒙古庫(kù)倫旗地區(qū)，修剪后放于溫室內(nèi)水培。

豚草采自遼寧省蓋州市高麗城和西海等地區(qū)。將采集的豚草葉片用清水洗凈，放于通風(fēng)陰涼處陰干，再用50 ℃烘箱烘干至恒重后，用中藥材粉碎機(jī)粉碎，稱重分裝于棕色試劑瓶中，放于陰涼處保存?zhèn)溆肹12-13]。

1.2 試驗(yàn)菌株

楊樹(shù)爛皮病菌株，購(gòu)自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)菌種保存中心，編號(hào)為88513。

2 試驗(yàn)方法

2.1 小葉楊爛皮病的致病性試驗(yàn)

采取燙傷和不燙傷兩種接種處理方法。接種前用75%的酒精消毒樹(shù)皮表面，不燙傷接種方法是用無(wú)菌手術(shù)刀在消毒的樹(shù)皮表面切去一小塊韌皮部，用接種針挑取適量菌絲放于切口處，再把切取的樹(shù)皮覆蓋在切口上；燙傷接種方法是用已燒熱的打孔器(直徑5 mm)刺入枝干，然后用手術(shù)刀在燙傷處切一圓形傷口(不傷害枝條的木質(zhì)部)，再將預(yù)先用打孔器(直徑5 mm)打好的菌柄接種于傷口處，最后將2種接種處理方法中的切口處均用浸泡無(wú)菌水的脫脂棉包好，用保鮮膜包扎保濕。為了后期的抑菌試驗(yàn)燙傷接種150個(gè)，未燙傷接種60個(gè)。每3 d換一次水，每天打兩次氧，保證枝條正常生長(zhǎng)。接種3 d后拆開(kāi)保鮮膜，開(kāi)始觀察“病斑”的發(fā)生發(fā)展情況，以“病斑”橫向大小為主要標(biāo)準(zhǔn)，記錄是否發(fā)病和發(fā)病癥狀[14-16]。

2.2 豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病的抑菌試驗(yàn)

2.2.1 含豚草粗提物培養(yǎng)基的制備 楊樹(shù)爛皮病病原菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)，采用溫浸-超聲波聯(lián)合提取法提取豚草粗提物。將滅好菌的培養(yǎng)基趁熱放于無(wú)菌的超凈工作臺(tái)中，當(dāng)培養(yǎng)基的溫度降至40 ℃左右時(shí)，將預(yù)先配置好的豚草粗提物溶液分別加入PDA培養(yǎng)基中，以加水為對(duì)照，使豚草粗提物在培養(yǎng)基中最終濃度分別為0、0.5、1.0、4.0、8.0、12.0、16.0 mg·mL-1，混合均勻后倒入平皿，待培養(yǎng)基冷卻后即得到含不同濃度豚草粗提物的PDA培養(yǎng)基，每個(gè)濃度重復(fù)6次[17-18]。

2.2.2 抑菌試驗(yàn) 在無(wú)菌條件下，用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器在預(yù)先培養(yǎng)好的楊樹(shù)爛皮病病原菌菌株平面上打成圓形菌柄，用無(wú)菌鑷子夾取菌柄放于含豚草粗提物的培養(yǎng)基中，每皿接種一塊，用封口膜封好，放于25 ℃的生物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[19-20]。

2.2.3 統(tǒng)計(jì)方法 采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定菌絲的生長(zhǎng)抑制率，并用DPS 18.10高級(jí)版LDS法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[21-22]。定期觀察菌絲的生長(zhǎng)情況，待對(duì)照菌絲延伸至平皿邊緣時(shí)停止生長(zhǎng)，用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，取2次的平均值計(jì)算抑菌率[23-24]，詳見(jiàn)式(1)和式(2)。

生長(zhǎng)直徑=測(cè)量菌絲直徑的平均值-菌柄的直徑

(1)

(2)

2.3 致病病斑的抑菌試驗(yàn)

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和致病病斑的數(shù)量，將豚草粗提物配置成20.0、40.0、80.0 mg·mL-1濃度的溶液，以不處理的病斑為對(duì)照。對(duì)已發(fā)病的小葉楊爛皮病病斑用無(wú)菌刀片順枝條方向刮破樹(shù)皮，用小毛刷進(jìn)行涂抹各濃度的豚草粗提物溶液，并在病斑邊緣用圓珠筆做好標(biāo)記，隔24 h再涂抹一次豚草粗提物溶液，觀察病斑的變化，統(tǒng)計(jì)抑菌效果，計(jì)算出平均抑菌率，確定適宜的抑菌濃度[25]，詳見(jiàn)式(3)。

平均抑菌率=(抑菌病斑數(shù)/處理病斑數(shù))×100%

(3)

3 結(jié)果與分析

3.1 致病性試驗(yàn)結(jié)果

燙傷與未燙傷2種接種處理結(jié)果見(jiàn)表1，由表1可知，未燙傷處理的枝條均未發(fā)病，而燙傷處理的枝條發(fā)病率為92.00%，燙傷接種后5 d菌柄周?chē)臉?shù)皮開(kāi)始變成黃色，慢慢向周?chē)鷶U(kuò)展，接種15 d后病斑平均直徑已達(dá)到19.13 mm。圖1為3株小葉楊枝條燙傷接種楊樹(shù)爛皮病病原菌的發(fā)病情況。

表1 小葉楊爛皮病的致病性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Pathogenicity test results of Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr. in P. simonii Carr.處理接種病斑數(shù)侵染病斑數(shù)發(fā)病率/%病斑平均直徑/mm燙傷15013892.0019.13未燙傷6000.000.00

3.2 楊樹(shù)爛皮病室內(nèi)抑菌試驗(yàn)結(jié)果

爛皮病病原菌菌絲在含豚草粗提取的PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)10 d對(duì)照組菌絲長(zhǎng)至平皿邊緣，此時(shí)各濃度的抑菌率見(jiàn)表2。由表2可知，豚草粗提物濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，平均抑菌率為68.32%；濃度為16.0 mg·mL-1時(shí)，抑菌率達(dá)到82.34%，且各處理間菌絲生長(zhǎng)直徑和抑菌率在0.05水平上存在顯著性差異。

圖2為豚草粗提物7個(gè)不同濃度處理對(duì)楊樹(shù)爛皮病病原菌的抑菌效果比較，圖3為16.0 mg·mL-1豚草粗提物對(duì)爛皮病的抑菌效果。由圖2和圖3可知，對(duì)照菌絲向外延伸至平皿邊緣，產(chǎn)生孢子，菌落為棕色，而豚草粗提物抑制后的菌絲向外延伸很小，菌落為白色，未產(chǎn)孢子。通過(guò)試驗(yàn)得到不同濃度的豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病有較好的抑菌作用，并隨濃度的增加而增大，豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病病原菌有較高的抑菌效果。

表2 不同濃度豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病病原菌的抑菌率Tab.2 Bacteriostatic rate of Ambrosia artemisiifolia L.crude ex-tracts with different concentrations to the pathogen of Cy-tospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物濃度/(mg·mL-1)處理10 d時(shí)菌落生長(zhǎng)直徑/mm抑菌率/%CK78.24 a0.00 f0.557.17 b26.68 e1.024.80 c68.32 d4.023.32 cd70.24 cd8.020.19 cd74.19 bc12.018.86 de75.93 b16.013.85 f82.34 a 注:同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理存在顯著差異 (P﹤0.05)。下同。

3.3 致病病斑的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)試驗(yàn)可知：3種濃度豚草粗提物對(duì)小葉楊爛皮病病斑的抑制效果均達(dá)到85%以上，40.0 mg·mL-1粗提物的平均抑菌率為91.89%，80.0 mg·mL-1粗提物平均抑菌率為92.11%，這說(shuō)明從40.0 mg·mL-1粗提物開(kāi)始，隨著豚草粗提物濃度的增加其抑菌效果而緩慢增大，抑制后病斑直徑與對(duì)照直徑在0.05水平上存在顯著性差異。從藥劑使用量和抑菌效果綜合考慮，豚草粗提物對(duì)小葉楊爛皮病病斑的最適宜抑制濃度為40.0 mg·mL-1。抑制效果見(jiàn)圖4，抑制的病斑向外幾乎無(wú)擴(kuò)大。

表3 豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病病斑的抑菌效果統(tǒng)計(jì)Tab.3 The bacteriostatic effect statistics of Ambrosia artemisiifolia L. extracts to Cytospora chrysosperma(Pers.) Fr.粗提物濃度/(mg·mL-1)處理病斑數(shù)/個(gè)抑制病斑數(shù)/個(gè)抑菌前病斑平均直徑/mm抑菌后病斑平均直徑/mm平均抑菌率/%CK25020.15 a23.47 a020.0373219.96 ab20.41 bc86.4940.0373419.63 ab19.66 c91.8980.0383519.56 b19.58 c92.11

4 結(jié)論與討論

通過(guò)研究，得到了爛皮病對(duì)燙傷接種處理的小葉楊枝條有較高的致病性，豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病及致病病斑具有較好的抑菌效果，并隨其濃度的增加抑菌率而增大。

試驗(yàn)材料小葉楊，屬于青楊派樹(shù)種，樹(shù)皮光滑易染病，便于觀察。致病性試驗(yàn)選用了燙傷和未燙傷兩種接種處理方法，燙傷接種處理的枝條發(fā)病率為92.00%，而未燙傷接種處理的枝條均未發(fā)病。可見(jiàn)在室內(nèi)枝條致病性試驗(yàn)中燙傷接種處理是爛皮病侵染的必要條件，燙傷可使傷口周?chē)_(dá)到無(wú)菌的環(huán)境，浸水脫脂棉保持菌絲生長(zhǎng)的濕度，周?chē)h(huán)境保證菌絲生長(zhǎng)的溫度，這些都有利于接種病原菌在枝條上侵染生長(zhǎng)。崔永亮等[26]以病斑愈合率為指標(biāo)。本試驗(yàn)枝條屬于離體水培，培養(yǎng)到一定時(shí)間，因營(yíng)養(yǎng)條件不足枝條枯萎，致病病斑經(jīng)豚草粗提物處理后未達(dá)到愈合的程度，所以本試驗(yàn)以平均抑菌率為主要指標(biāo)確定抑菌效果。在原有試驗(yàn)基礎(chǔ)上，還需研究楊樹(shù)爛皮病對(duì)其他派楊樹(shù)品種的致病性，得出侵染規(guī)律，利于后期開(kāi)展野外林地的抑菌試驗(yàn)。同時(shí)還需開(kāi)展豚草粗提物與廣譜殺菌劑抑菌效果比較。

前人已經(jīng)開(kāi)展了豚草粗提物對(duì)楊樹(shù)爛皮病的室內(nèi)抑菌試驗(yàn)，筆者在前人研究基礎(chǔ)上開(kāi)展了小葉楊離體枝條爛皮病的致病性和豚草粗提物對(duì)小葉楊爛皮病致病病斑的抑菌作用研究，以期為豚草粗提物用于林業(yè)病害的野外防治及果樹(shù)、一些觀賞樹(shù)木病害防治提供前期的試驗(yàn)基礎(chǔ)，為確定用于生產(chǎn)和防治工作的新型植物源農(nóng)藥提供前期研究基礎(chǔ)，對(duì)推進(jìn)無(wú)公害農(nóng)藥的研究和應(yīng)用有著重大的意義。