禹靚倩， 吳 毅， 彭繼慶， 李嬌婕， 譚志超， 曹基武

(1.中南林業(yè)科技大學(xué)林學(xué)院， 湖南 長沙 410004； 2.臨武縣恒心生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限責(zé)任公司， 湖南 臨武 424300)

櫟屬Q(mào)uercus為殼斗科Fagaceae常綠或落葉喬木、稀灌木，其樹種具有壽命長、生物量大、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強、林冠層茂密、層片結(jié)構(gòu)復(fù)雜、生物多樣性指數(shù)高等特點[1]，是常見的森林建群樹種，對于豐富我國造林樹種資源、提升苗木產(chǎn)業(yè)化水平，維持生態(tài)平衡、保護(hù)生態(tài)安全、推動生態(tài)文明建設(shè)方面具有重要意義。櫟屬樹種木材密度大于0.75 g·cm-3，屬于優(yōu)質(zhì)硬木，果實富含淀粉與糖，樹皮、枝葉、種殼中富含制革工業(yè)所需的重要原料——鞣質(zhì)，經(jīng)濟(jì)價值高。櫟屬樹種在全球分布廣泛，約有450種，其中我國有51種，主要分布在四川、云南、貴州、西藏、陜西、浙江、山東等地，是櫟屬樹種分布較多的國家之一[2]。櫟屬樹種種間在性狀上有較多交叉，導(dǎo)致產(chǎn)生了多系類群，利用合適的分子標(biāo)記進(jìn)行系統(tǒng)研究，成為解決植物類群網(wǎng)狀進(jìn)化的有效途徑。前人已經(jīng)利用RAPD標(biāo)記對秦嶺4個類型的天然栓皮櫟種群進(jìn)行了研究，結(jié)果表明栓皮櫟的總體遺傳多樣性水平高、遺傳分化大、遺傳變異高，其UPGMA聚類結(jié)果也與形態(tài)學(xué)分類基本一致[3]；秦英英等[4]運用SSR標(biāo)記對山西省遼東櫟自然居群遺傳多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明遼東櫟群體絕大多數(shù)遺傳變異發(fā)生在群體內(nèi)，并且遺傳距離與地理距離之間具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。除此之外，還有學(xué)者對蒙古櫟、無梗花櫟、夏櫟、歐洲栓皮櫟進(jìn)行EST-SSR信息分析，了解了四種櫟類不同基元的EST-SSR的分布頻率具有非常一致的特征[5]；利用AFLP標(biāo)記對不同海拔的川滇高山櫟進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著海拔高度的降低，其遺傳變異水平呈由低到高再到低的分布[6-7]。ISSR(簡單重復(fù)間區(qū)序列，intersimple sequence repeat)是基于SSR發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù)，該技術(shù)的多態(tài)性及可重復(fù)性高、試驗操作簡單、成本低、還可揭示基因組水平的某些特征，且呈孟德爾式遺傳，因此該技術(shù)在遺傳多樣性研究中被充分利用[8]。以往的研究往往局限于單種或者少量種內(nèi)部多樣性比較和簡單的類群劃分，有關(guān)大樣本不同種(品種)群間的多樣性差異以及親緣關(guān)系研究還不清楚。本研究對櫟屬27種樹種進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析，探討種間和品種間的親緣關(guān)系，以期為櫟屬樹種的遺傳多樣性檢測、品種鑒定、系統(tǒng)分類以及新品種培育的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料分別來源于湖南長沙中南林業(yè)科技大學(xué)校區(qū)、山東日照、黑龍江雞西與西藏拉薩4個引種栽培區(qū)，共27種(見表1)。采集同一株上葉片完整、生長狀況好、無病蟲害的5～8片新鮮葉片作為試驗材料，用濕紗布擦凈后封入自封袋中，需將采集的樣品盡快帶回實驗室，置于-70 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 試驗材料及來源Tab.1 Experimental material and source序號名稱學(xué)名采集地點1短柄枹櫟Q. serrata湖南長沙2弗吉尼亞櫟Q. virginiana 湖南長沙3小葉櫟Q. chenii湖南長沙4栓皮櫟Q. variabilis湖南長沙5娜塔櫟Q. nuttallii湖南長沙6舒馬櫟Q. shumardii湖南長沙7夏櫟Q. robur湖南長沙8針櫟Q. palustris湖南長沙9蒙古櫟Q. mongolica黑龍江雞西10川滇高山櫟Q. aquifolioides西藏拉薩11柳葉櫟Q. phellos湖南長沙12南方紅櫟Q. falcata湖南長沙13麻櫟Q. acutissima湖南長沙14大果櫟Q. macrocarpa湖南長沙15水櫟Q. nigra湖南長沙16白櫟Q. fabri湖南長沙17橢圓果櫟Q. ellip-soidalis山東日照18星毛櫟Q. stellata山東日照19北美紅櫟Q. rubra湖南長沙20月桂葉櫟Q. hemisphaerica湖南長沙21烏岡櫟Q. phillyraeoides湖南長沙22加州白櫟Q. lyrata山東日照23沼生櫟Q. palustris湖南長沙24無柄櫟Q. imbricaria湖南長沙25沼生栗櫟Q. michauxii山東日照26北方針櫟Q. ellipsoidalis山東日照27沼生紅櫟Q. shumardii湖南長沙

1.2 DNA提取與檢測

試驗在中南林業(yè)科技大學(xué)實驗室進(jìn)行。將采集到的葉片用液氮研磨成粉末后裝入離心管，隨后采用北京天根生物科技有限責(zé)任公司的植物基因組DNA提取試劑盒對27種櫟屬樹種進(jìn)行DNA的提取，操作步驟按照說明書要求進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。使用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進(jìn)行檢測，選取出條帶清晰、沒有拖帶、沒有受到RNA及蛋白質(zhì)污染的樣品，利用紫外分光光度法測定DNA的純度與濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物篩選及ISSR-PCR擴增

采用哥倫比亞大學(xué)公布的ISSR引物作為PCR擴增引物。優(yōu)化后確定ISSR-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：1 μL的DNA，1 μL ISSR引物，8 μL ddH2O，10 μL Buffer；PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，在55 ℃下，退火45 s，72 ℃延伸90 s，共36個循環(huán)，72 ℃總延伸420 s，4 ℃保存[9]。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測所得PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)成像，從中選出擴增條帶清晰、數(shù)量多、條帶質(zhì)量高的引物用于27種櫟屬樹種遺傳多樣性檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

根據(jù)ISSR-PCR擴增出的圖譜，人工進(jìn)行比對，可清晰辨認(rèn)出的條帶記為“1”，沒有條帶或者條帶不清晰的記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫；數(shù)據(jù)利用PopGen 32 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行分析計算，聚類分析通過 Mega 6 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳對提取的DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，各個泳道的條帶清晰明亮，無拖帶及受到RNA、蛋白質(zhì)污染的情況。紫外分光光度法測得所有樣品的DNA濃度為40～200 ng·μL-1，A260/A280在0.77～2.09之間。

2.2 ISSR-PCR擴增多態(tài)性

從100條引物中篩選出12條對27種櫟屬樹種進(jìn)行擴增，得到12條擴增效果很好的引物(見表2)。12條引物共擴增出140個位點(部分引物擴增結(jié)果見圖1)，其中有115個是多態(tài)位點，每個引物平均擴增了11.7個位點、9.6個多態(tài)位點，多態(tài)位點比率為82.14%,說明櫟樹遺傳多樣性較為豐富，環(huán)境適應(yīng)能力較強。在這些引物中，引物UBC864擴增出的位點最多，有16個；引物UBC812的擴增僅為9個。多態(tài)位點比率最高是引物UBC835，為100%；最低是UBC825，僅為66.67%。

2.3 櫟樹的遺傳多樣性

利用PopGen 32軟件計算27種櫟屬樹種的遺傳多樣性，結(jié)果見表3，在27種材料中，多態(tài)位點比率為82.14%，但各類群間多態(tài)位點比率差異較大。Ⅰ類群的多態(tài)位點數(shù)為31個，多態(tài)位點比率為22.14%；Ⅱ類群的最低，有27個，多態(tài)位點比率為19.29%；Ⅲ類群的多態(tài)位點數(shù)最多，有97個，多態(tài)位點比率為69.29%，表明Ⅲ類群與其它幾個類群相比具有較高的遺傳變異，基因交流較頻繁，有較強的環(huán)境適應(yīng)力；Ⅳ類群多態(tài)位點有39個，多態(tài)位點比率為27.86%。27種櫟屬樹種的觀測等位基因數(shù)(Na)為1.807 1，有效等位基因數(shù)(Ne)為1.368 8，Nei′s 基因多樣性指數(shù)(H)為0.231 9，Shannon’s多樣性指數(shù)(I)為0.362 1，這表明27種櫟屬樹種具有較高的遺傳多樣性。

表2 ISSR引物擴增結(jié)果統(tǒng)計Tab.2 The statistic of ISSR amplification result引物編號引物序列熔解溫度/℃退火溫度/℃擴增總位點數(shù)多態(tài)位點數(shù)多態(tài)位點比率/%UBC807AGAGAGAGAGAGAGAGT5051111090.91UBC811GAGAGAGAGAGAGAGAC525011981.82UBC812GAGAGAGAGAGAGAGAA52509777.78UBC825ACACACACACACACACT505012866.67UBC827ACACACACACACACACG5052121083.33UBC835AGAGAGAGAGAGAGAGYC50511212100.00UBC836AGAGAGAGAGAGAGAGYA525111872.73UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT505011981.82UBC846CACACACACACACACART525211872.73UBC857CACACACACACACACART505312975.00UBC864ATGATGATGATGATGATG5053161593.75UBC880GGAGAGGAGAGGAGA5053121083.33總計14011582.14

表3 27種櫟屬樹種的遺傳多樣性分析Tab.3 The genetic diversity parameters of 27 Quercus L.類群樣本數(shù)N多態(tài)位點多態(tài)位點比率/%觀測等位基因數(shù)Na有效等位基因數(shù)NeNei's基因多樣性HShannon's多樣性指數(shù)IⅠ23122.141.221 41.156 60.091 70.133 9Ⅱ22719.291.192 91.136 40.079 90.116 6Ⅲ209769.291.692 91.316 10.199 00.310 4Ⅳ23927.861.278 61.197 00.115 40.168 5Ⅴ1——————

2.4 聚類結(jié)果與親緣關(guān)系分析

利用PopGen 32軟件結(jié)合Mega 6軟件對27種櫟屬樹種進(jìn)行聚類分析，可將其分為5大類群(見圖2)，分別命名為Ⅰ(2種)、Ⅱ(2種)、Ⅲ、(20種)Ⅳ(2種)和Ⅴ(1種)類群，Ⅰ類群包含了短柄枹櫟和白櫟；Ⅱ類群為小葉櫟和娜塔櫟；Ⅲ類群較為復(fù)雜，包含了舒瑪櫟、針櫟、柳葉櫟、南方紅櫟、北美紅櫟、月桂葉櫟、沼生櫟、無柄櫟、北方針櫟、沼生紅櫟、大果櫟、星毛櫟、沼生栗櫟、水櫟、麻櫟、加州白櫟、蒙古櫟、川滇高山櫟、烏岡櫟、橢圓果櫟；Ⅳ類群為夏櫟和弗吉尼亞櫟；Ⅴ類群為栓皮櫟。隨后將這5大類群進(jìn)行聚類，結(jié)果如圖3所示，5個類群可以聚為兩大類，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群聚在一起，Ⅴ類群單獨聚為一類。

利用PopGen 32軟件對27種櫟屬樹種進(jìn)行遺傳一致度與遺傳距離分析，27種櫟屬樹種遺傳一致度的變化范圍在0.542 9～0.900 0之間，遺傳距離在0.105 4～0.610 9之間，其中紅櫟組中的北美紅櫟與月桂葉櫟的遺傳一致度最高，為0.900 0，兩者之間的親緣關(guān)系相對較近；栓皮櫟和橢圓果櫟遺傳一致度最低，為0.542 9，兩者之間的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。

3 討論

3.1 櫟屬樹種的親緣關(guān)系

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各種植物遺傳多樣性、指紋圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系等方面。在櫟樹方面，有研究運用SSR對櫟屬近緣種進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，并對其遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為櫟屬近緣種的鑒定及分類提供了重要依據(jù)[10]；Liu等[11]運用ISSR-PCR方法構(gòu)建紅錐、白錐、大葉櫟的DNA指紋圖譜，完善這3個樹種的分子鑒定方面的研究。此外還有研究利用分子標(biāo)記技術(shù)對白櫟、遼東櫟、栓皮櫟及其近緣種進(jìn)行遺傳多樣性分析[4，12-13]。

櫟屬因存在普遍的種間自然雜交，其屬下分類一直存在爭議。國外學(xué)者將櫟屬分為Sect.Cerris，Sect.Mesobalanus，Sect.Lepidobalanus，Sect.Macrobalanus，Sect.P rotobalanis和Sect.Erythrobalanus 6個組[14]。根據(jù)中國樹木志將櫟屬分為槲櫟組(即為白櫟組)、紅櫟組、麻櫟組、高山櫟組和巴東櫟組等[15]。《中國植物志》將中國櫟屬分為51種[16]，而有些學(xué)者則將一些分類地位模糊不清的種做了歸并，認(rèn)為只有35種。由圖2可知，27種櫟屬樹種聚分為5類，Ⅰ類群為短柄枹櫟和白櫟，兩者親緣關(guān)系較近，均屬于白櫟組。Ⅱ類群一個是小葉櫟，屬于麻櫟組，一個為娜塔櫟，屬于紅櫟組，這組聚類與傳統(tǒng)分類不一致。Ⅲ類群較為復(fù)雜，共有20個櫟樹品種，為紅櫟組、白櫟組、巴東櫟組等，其中絕大多數(shù)為紅櫟組，與傳統(tǒng)分類不一致；其中，紅櫟組的北美紅櫟和月桂葉櫟遺傳一致度最高，為0.900 0，遺傳距離為0.105 4，兩者親緣關(guān)系最為接近；栓皮櫟和橢圓果櫟遺傳一致度最低，為0.542 9，遺傳距離為0.610 9，兩者之間的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。南方紅櫟與柳葉櫟親緣關(guān)系較近。Ⅳ類群為弗吉尼亞櫟與夏櫟聚為一組，兩者親緣關(guān)系較近。Ⅴ類群只有栓皮櫟，與其他類群之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在實際育種工作中，需要避免大量選擇親緣關(guān)系較近的材料作為親本，這樣有利于優(yōu)良性狀基因的組合。此外，櫟屬樹種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近并不一定與其來源相關(guān)，聚類分析中部分地理來源一致的材料聚在同一類，但也有一些地理來源不一致的材料聚在一類，并未完全按照來源地進(jìn)行聚類分組，材料之間存在一定交叉，顯示了復(fù)雜的親緣關(guān)系。

3.2 下一步研究

為了建立更完善的櫟屬樹種分類系統(tǒng)，今后需要進(jìn)一步擴大樣本采集范圍與數(shù)量，并將ISSR分子標(biāo)記試驗結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)分類的研究結(jié)果相結(jié)合，為櫟屬樹種的分類研究、育種親本的選配提供參考。

我國具有豐富的櫟屬樹種資源，其生態(tài)與經(jīng)濟(jì)價值不可估量，但在櫟屬樹種遺傳及育種方面的研究與國外存在一定差距，且櫟屬樹種為風(fēng)媒異交植物，自然雜交十分常見，其種間還可發(fā)生漸滲雜交。因此，櫟屬種間表現(xiàn)出十分復(fù)雜的形態(tài)特征，種間分類困難[17]。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可很好的區(qū)分27種櫟屬樹種，并得出其多態(tài)位點百分率，遺傳距離、遺傳一致度等一系列數(shù)據(jù)，有助于進(jìn)一步了解櫟屬樹種的遺傳基礎(chǔ)，該技術(shù)也可應(yīng)用到櫟屬新品種鑒定、雜交親本的選配與新種質(zhì)資源的劃分等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。

4 結(jié)論

本研究從100條引物中篩選出12條ISSR引物用于櫟屬樹種的ISSR-PCR擴增，并且擴增出的條帶豐富、清晰穩(wěn)定、重復(fù)性好。12條ISSR引物能夠?qū)?7種屬樹種擴增出140個位點，平均每條引物能產(chǎn)生11.7個位點。在擴增出的位點中，有115個是多態(tài)位點，多態(tài)位點比率為82.14%，并且12條引物擴增出的位點豐富、清晰穩(wěn)定，表明櫟屬植物在進(jìn)化的過程中具有較豐富的遺傳變異，同時說明ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能夠?qū)⑺麄儏^(qū)分開來。27種櫟屬樹種中北美紅櫟與月桂葉櫟的遺傳一致度最高，為0.900 0；栓皮櫟和橢圓果櫟遺傳一致度最低，為0.542 9。