于賀軍，李冰，薛秀娟，徐璐，程棟

1新鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病防治科，河南 新鄉(xiāng) 453000

2新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院檢驗科，河南 新鄉(xiāng) 453000

2018年全球腫瘤統(tǒng)計數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，全球約有1819萬惡性腫瘤新增病例，約有960萬惡性腫瘤死亡病例。在全球范圍內(nèi)，前列腺癌的發(fā)病率位居第3位，占全球總發(fā)病人數(shù)的7.1%[1]。在中國，前列腺癌的發(fā)病率和病死率均位居男性惡性腫瘤的第2位，僅次于肺癌，嚴重危害男性的健康，尤其是老年男性的健康[2]。因此，進一步探討前列腺癌的病因及發(fā)病機制是必要的。細胞周期蛋白D1（cyclin D1）是一種與細胞增殖密切相關(guān)的周期蛋白，在多種類型的腫瘤中異常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[3]。p27作為細胞周期的負調(diào)控因子，通過抑制細胞增殖參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[4]。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）與細胞合成DNA的過程密切相關(guān)，作為細胞增殖的標志物，其表達量的增加預(yù)示著腫瘤細胞的增殖能力進一步增強[5]。本研究采用免疫組化法檢測cyclin D1、p27、PCNA在前列腺癌組織中的表達情況，以進一步探討前列腺癌的發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2018年12月至2019年12月新鄉(xiāng)市疾病預(yù)防控制中心和新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院收治的接受經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)的86例前列腺癌患者。納入標準：均經(jīng)病理檢查證實，且術(shù)前均未接受過內(nèi)分泌治療和放療。排除標準：合并心、肝、腎等嚴重疾?。缓喜⑵渌[瘤；有其他藥物治療史。前列腺癌患者的年齡為49～78歲，中位年齡為65歲，其中，≤65歲42例，＞65歲44例；根據(jù)美國癌癥聯(lián)合會前列腺癌TNM分期系統(tǒng)（2018年）[6]進行分期：Ⅰ期26例，Ⅱ期32例，Ⅲ期15例，Ⅳ期13例；參照2011版《中國泌尿外科疾病診斷指南》[7]，Gleason評分≤7分為中高分化（n=64），＞7分為低分化（n=22）；有骨轉(zhuǎn)移43例，無骨轉(zhuǎn)移43例。另收集同期38例前列腺增生患者，納入標準：年齡為50～80歲；國際前列腺癥狀評分（international prostatic symptom score，IPSS）高于13分，殘余尿量在150 ml以內(nèi)。排除標準：合并膀胱結(jié)石、膀胱頸硬化、尿道狹窄、前列腺癌、膀胱腫瘤等；合并心、肝、肺、腎功能障礙等。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，患者及家屬均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器

兔抗人cyclin D1、p27和PCNA多克隆抗體均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。RMI128切片機購自德國萊卡公司；BH-2顯微鏡購自日本OLYMPUS公司。

1.3 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學染色法檢測前列腺癌組織和前列腺增生組織中cyclin D1、p27及PCNA的表達情況。所有標本經(jīng)10%福爾馬林固定、脫水、透明、石蠟包埋，切成厚度為5 μm切片，放入60℃烤箱烘烤后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟，梯度乙醇脫水，微波爐加熱進行抗原修復(fù)，采用3%過氧化氫進行內(nèi)源性滅活，切片分別滴加cyclin D1、p27及PCNA一抗工作液，4℃孵育過夜，次日滴加生物素二抗工作液，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光鏡下觀察cyclin D1、p27及PCNA的染色情況。選取磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判讀

根據(jù)染色強度以及高倍鏡下陽性細胞所占比例進行分析。cyclin D1、p27及PCNA陽性細胞主要定位于細胞質(zhì)、細胞核，陽性顆粒呈棕黃色。采用半定量積分法對染色結(jié)果進行判定：每張切片隨機選取10個高倍鏡視野，統(tǒng)計陽性細胞數(shù)，分析其染色程度。陽性細胞所占百分比：陽性細胞所占百分比≤5%計0分，6%～25%計1分，26%～50%計2分，51%～75%計3分，＞75%計4分。陽性細胞染色強度：無色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分。上述兩項相乘的得分為最終得分，其中，0分為陰性（-），1～4分為弱陽性（+），5～8分為中等陽性（++），9分及以上為強陽性（+++）。中等陽性和強陽性表示細胞陽性表達。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman等級相關(guān)分析法進行相關(guān)性分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中cyclin D1、p27、PCNA表達情況的比較

前列腺癌組織中cyclin D1、PCNA的陽性表達率均明顯高于前列腺增生組織，p27的陽性表達率明顯低于前列腺增生組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1 不同組織中cyclin D1、p27、PCNA陽性表達情況的比較[n（%）]

2.2 cyclin D1、p27、PCNA 與前列腺癌患者臨床特征的關(guān)系

低分化、有骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者前列腺癌組織中p27的陽性表達率分別低于高分化、無骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，PCNA的陽性表達率分別高于高分化、無骨轉(zhuǎn)移的前列腺癌患者，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=5.723、24.870、4.724、18.169，P＜0.05）。不同年齡、TNM分期前列腺癌患者前列腺癌組織中p27、PCNA的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。不同年齡、分化程度、TNM分期、骨轉(zhuǎn)移情況前列腺癌患者前列腺癌組織中cyclin D1的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表 2）

表2 不同臨床特征前列腺癌患者前列腺癌組織中cyclin D1、p27、PCNA的陽性表達情況

2.3 前列腺癌組織中cyclin D1、p27、PCNA表達的相關(guān)性

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，前列腺癌組織中cyclin D1與p27的表達呈負相關(guān)（r=-0.687，P＜0.01），cyclin D1與PCNA的表達呈正相關(guān)（r=0.612，P＜0.01），p27與PCNA的表達呈負相關(guān)（r=-0.598，P＜0.01）。

3 討論

D型細胞周期蛋白家族包括cyclin D1、cyclin D2、cyclin D3三種蛋白，其中，cyclin D1主要位于染色體11q13，含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，能夠編碼含有295個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量約為34 kD。cyclin D1通過與細胞周期蛋白依賴性激酶4/6（cyclin-dependent kinases 4/6，CDK4/6）結(jié)合使視網(wǎng)膜母細胞瘤（retinoblastoma，Rb）蛋白磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，進而啟動脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的合成，加速細胞周期從G1期向S期轉(zhuǎn)變，因此，其具有腫瘤基因的性質(zhì)，能夠造成細胞增殖失控及惡性生長，最終形成腫瘤[8]。研究顯示，cyclin D1在多種惡性腫瘤中的表達量明顯增加。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中cyclin D1的陽性表達率明顯高于前列腺增生組織，與相關(guān)研究結(jié)果[9-10]類似，說明cyclin D1作為腫瘤基因參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展。亦有研究發(fā)現(xiàn)，通過抑制cyclin D1的表達能明顯阻滯DU145前列腺癌細胞的細胞周期[11]，說明cyclin D1可能能夠作為前列腺癌基因治療中的一種靶基因。

p27是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子家族成員之一，通過參與細胞周期的調(diào)控從而影響細胞的生物學行為。p27作為細胞周期負性調(diào)控因子，通過抑制CDK的活性阻止G1期向S期轉(zhuǎn)化，抑制細胞增殖，從而被認為是一種腫瘤基因參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[12]。劉偉等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中p27的陽性表達率低于前列腺增生組織，并與患者的Gleason評分、骨轉(zhuǎn)移情況及TNM分期有關(guān)。廖順鴻[14]的研究表明，前列腺癌組織中p27的陽性表達率低于癌旁正常組織，并與腫瘤的分化程度、轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。本研究的結(jié)果與上述研究結(jié)果類似，p27在前列腺癌組織中的陽性表達率明顯低于前列腺增生組織，并與腫瘤的分化程度、骨轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，與年齡、TNM分期無關(guān)，說明p27與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及分化密切相關(guān)，通過上調(diào)p27的表達能在一定程度上抑制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。

PCNA是1978年從系統(tǒng)性紅斑狼瘡中發(fā)現(xiàn)并命名的一種存在于細胞核中的蛋白質(zhì)，定位于人染色體20，并與細胞合成DNA密切相關(guān)。PCNA在細胞周期G0期開始表達，S期達到峰值，M期開始回落。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組織中PCNA的陽性表達率明顯高于前列腺增生組織，并與腫瘤的分化程度、骨轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，與TNM分期無關(guān)，與相關(guān)研究結(jié)果[15-16]一致，說明PCNA的陽性表達率越高，前列腺癌細胞增殖越旺盛，細胞分化程度越低，復(fù)制時間越短，轉(zhuǎn)移速度越快。

本研究的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，前列腺癌組織中cyclin D1與p27的表達呈負相關(guān)，cyclin D1與PCNA的表達呈正相關(guān)，p27與PCNA的表達呈負相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，cyclin D1與PCNA在惡性多形性腺瘤中的表達呈正相關(guān)[15]。cyclin D1與p27在胃癌組織中的表達呈負相關(guān)，二者在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[17-19]。cyclin D1、p27、PCNA三者聯(lián)合檢測可能能夠為前列腺癌的診斷與治療提供依據(jù)。

綜上所述，cyclin D1、PCNA在前列腺癌組織中的陽性表達率高，p27在前列腺癌組織中的陽性表達率低，且PCNA、p27的表達情況與前列腺癌的分化程度和骨轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。三者在前列腺癌中的表達具有相關(guān)性，參與前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，其聯(lián)合檢測可能能夠為前列腺癌的診斷提供依據(jù)。