常杰

作者單位：河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，河南 開封475000

糖尿病腎病是一種進(jìn)行性腎病，由糖尿病微血管并發(fā)癥引發(fā)，常常導(dǎo)致終末期腎?。?］，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，附在腎小球基底膜外表面，維持腎小球基底膜完整性［2］。資料顯示，足細(xì)胞是糖尿病腎病重要的早期靶細(xì)胞［3］，在糖尿病腎病進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用［4］，因此，研究足細(xì)胞凋亡可能為糖尿病腎病提供一種新的治療策略。微小 RNAs（MicroRNAs，miRNAs/miR）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，參與細(xì)胞增殖、凋亡、周期、分化等多種生物學(xué)過程。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs與糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制有關(guān)，可作為診斷、預(yù)后及治療的生物標(biāo)志物［5-7］。微小RNA-204-3p（MicroRNA-204-3p，miR-204-3p）在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，可以抑制高糖導(dǎo)致的足細(xì)胞凋亡［8］，但miR-204-3p是否通過靶向調(diào)控鋅指蛋白Krüppel樣因子 6（Krüppel-like factor 6，KLF6）表達(dá)來影響高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，這方面的研究尚未見諸報(bào)道。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討miR-204-3p是否通過靶向調(diào)控KLF6從而影響高糖刺激的小鼠足細(xì)胞損傷，旨在闡明其作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心，RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清、胰酶、D-葡萄糖、γ干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）購于Sigma公司，Lipofectamine 2000購于美國Invitrogen公司，miR-204-3p、si-KLF6、熒光素酶報(bào)告載體購于上海吉瑪生物有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)定量PCR（Quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）試劑盒購于美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)蛋白（synaptopodin）抗體、結(jié)蛋白（desmin）抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、KLF6抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase-3）抗體、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）抗體購于美國Cellular Signaling Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗、凋亡試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)研究所，ELC化學(xué)發(fā)光試劑盒購于美國Thermo公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo公司，7500實(shí)時(shí)定量PCR儀購于美國ABI公司，倒置顯微鏡購于日本Olympus公司，酶標(biāo)儀購于德國Eppendorf公司，BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀購于美國BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)MPC5細(xì)胞培養(yǎng)依據(jù)Li等［9］的方法，細(xì)胞中加入含10%胎牛血清、10 U/mL IFN-γ、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液，在33℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待MPC5細(xì)胞融合至80%，按1∶2～1∶3的比例接種傳代。誘導(dǎo)足細(xì)胞分化時(shí)，將MPC5細(xì)胞轉(zhuǎn)入不含IFN-γ的培養(yǎng)液，置37℃孵育2周。實(shí)驗(yàn)前，血清饑餓24 h以同步化細(xì)胞。

1.3細(xì)胞分組與轉(zhuǎn)染收集MPC5細(xì)胞，加入D-葡萄糖進(jìn)行干預(yù)，將細(xì)胞按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組（NG組，D-葡萄糖5 mmol/L），高糖刺激組（HG組，D-葡萄糖30 mmol/L），miR-204-3p過表達(dá)組（HG+miR-204-3p組和HG+miR-NC組，miR-204-3p或miR-NC轉(zhuǎn)染高糖刺激組細(xì)胞），抑制KLF6表達(dá)組（HG+si-KLF6組和HG+si-NC組，si-KLF6或si-NC轉(zhuǎn)染高糖刺激組細(xì)胞），KLF6過表達(dá)組（HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6組和HG+miR-204-3p+pcDNA組，miR-204-3p和pcDNA-KLF6或miR-204-3p+pcDNA共轉(zhuǎn)染高糖刺激組細(xì)胞），培養(yǎng)48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑說明書步驟，將miR-204-3p、si-KLF6、pcDNA-KLF6及各自對(duì)照轉(zhuǎn)染入MPC5細(xì)胞，并培養(yǎng)48 h備用。

1.4 qPCR檢測(cè)目的基因表達(dá)提取MPC5細(xì)胞總RNA，合成互補(bǔ)DNA（cDNA），以制成的cDNA為模板，檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-204-3p與KLF6 mRNA水平。在實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，條件設(shè)置為95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)后檢測(cè)擴(kuò)增曲線和熔解曲線，收集Ct值，以2-ΔΔCt法進(jìn)行分析，計(jì)算miR-204-3p與KLF6 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.5蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot）檢測(cè)目的蛋白表達(dá)為檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，在細(xì)胞中加入RIPA裂解液充分提取總蛋白，蛋白與上樣緩沖液混勻，沸水變性10 min，后經(jīng)10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，以一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，用Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液（Tris buffered saline with Tween，TBST）充分洗膜，室溫下用辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶2 000）孵育1 h，TBST充分洗膜，ECL進(jìn)行顯色、顯影，拍照，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集MPC5細(xì)胞，加入胰酶消化，將細(xì)胞密度調(diào)整為1×105/mL，加入500μL膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μL Annexin V-異硫氰酸熒光素（FITC）和5μL碘化丙啶（PI），于室溫黑暗條件孵育30 min，上流式細(xì)胞儀評(píng)估細(xì)胞凋亡率。

1.7靶基因預(yù)測(cè)及雙熒光素酶報(bào)告基因利用生物 信 息 學(xué) 軟 件 TargetScan（http：//www.targetscan.org/）預(yù)測(cè) KLF6的 3’非翻譯區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）中含有與miR-204-3p互補(bǔ)的核苷酸序列，構(gòu)建野生型（WT-KLF6）和突變型（MUT-KLF6）KLF6的3’UTR熒光素酶報(bào)告基因載體，并分別共轉(zhuǎn)染miR-204-3p或anti-miR-204-3p，培養(yǎng)48 h后，根據(jù)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒步驟測(cè)定雙熒光素酶活性。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以表示，采用SPSS 22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析比較多組數(shù)據(jù)間差異，采用SNK-q檢驗(yàn)比較組間多重差異，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞中的表達(dá)HG組高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞MPC5中miR-204-3p表達(dá)量較NG組顯著降低（P＜0.05），KLF6 mRNA和蛋白表達(dá)量明顯提高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)KLF6在高糖誘導(dǎo)小鼠腎臟足細(xì)胞中的表達(dá)

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導(dǎo)小鼠腎臟足細(xì)胞中的表達(dá)/

表1 miR-204-3p和KLF6在高糖誘導(dǎo)小鼠腎臟足細(xì)胞中的表達(dá)/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，NG組為正常對(duì)照組，HG組為高糖刺激組

KLF6蛋白0.46±0.04 0.89±0.08 14.423＜0.001組別NG HG t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 miR-204-3p 1.02±0.08 0.41±0.04 20.460＜0.001 KLF6 mRNA 1.03±0.08 2.86±0.27 19.496＜0.001

2.2 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞中synaptopodin和desmin表達(dá)的影響蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于NG組，HG組小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5中miR-204-3p和synaptopodin蛋白表達(dá)量顯著降低，desmin表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）。相比于HG+miR-NC組，miR-204-3p過表達(dá)大幅增加高糖刺激的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5中miR-204-3p表達(dá)量（P＜0.05），表明轉(zhuǎn)染成功。miR-204-3p過表達(dá)明顯提高高糖刺激的小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5中synaptopodin蛋白水平，降低desmin蛋白水平（P＜0.05）。見圖2、表2。

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞中synaptopodin和desmin表達(dá)的影響

2.3 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞凋亡的影響與NG組比較，HG組小鼠腎臟足MPC5細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。與HG+miR-NC組比較，miR-204-3p過表達(dá)小鼠腎臟足MPC5細(xì)胞凋亡率顯著減少（P＜0.05），明顯提高Bcl-2蛋白水平而降低Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白水平（P＜0.05）。見圖3、表3。

表2 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞中synaptopodin和desmin表達(dá)的影響/

表2 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞中synaptopodin和desmin表達(dá)的影響/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，synaptopodin為肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)蛋白，desmin為結(jié)蛋白，NG為正常對(duì)照組，HG為高糖刺激組，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對(duì)照（miR-NC）干預(yù)組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-NC干預(yù)組miR-204-3p干預(yù)。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+miR-NC組比較，bP＜0.05

desmin蛋白0.34±0.03 0.81±0.07a 0.83±0.08 0.41±0.04b 174.500＜0.001組別NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 miR-204-3p 1.00±0.09 0.32±0.03a 0.34±0.04 0.86±0.08b 261.176＜0.001 synaptopodin蛋白0.76±0.07 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.67±0.06b 177.641＜0.001

表3 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

表3 miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，NG為正常對(duì)照組，HG為高糖刺激組，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對(duì)照（miR-NC）干預(yù)組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-NC干預(yù)組miR-204-3p干預(yù)，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白，cleaved-caspase-3為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+miR-NC組比較，bP＜0.05

cleavedcaspase-3蛋白0.24±0.03 0.59±0.05a 0.61±0.06 0.35±0.03b 150.797＜0.001組別NG HG HG+miR-NC HG+miR-204-3p t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3細(xì)胞凋亡率/%5.26±0.64 22.46±2.08a 24.58±2.47 11.25±1.65b 224.087＜0.001 Bcl-2蛋白0.68±0.06 0.28±0.03a 0.26±0.03 0.59±0.05b 208.823＜0.001 Bax蛋白0.31±0.03 0.73±0.07a 0.76±0.07 0.42±0.04b 147.220＜0.001

2.4抑制KLF6表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的影響相較于NG組，HG組小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5中KLF6蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白表達(dá)量及細(xì)胞凋亡率顯著增加（P＜0.05），synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.05）。HG+si-KLF6組小鼠腎臟足細(xì)胞MPC5中KLF6蛋白水平較HG+si-NC組顯著降低（P＜0.05），表明轉(zhuǎn)染成功。相較于HG+si-NC組，HG+si-KLF6組抑制KLF6表達(dá)明顯提升synaptopodin蛋白及Bcl-2蛋白水平（P＜0.05），而降低desmin蛋白、Bax蛋白水平及細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。見圖4、表4。

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)抑制KLF6表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的影響

2.5 miR-204-3p靶向調(diào)控KLF6表達(dá)通過TargetScan網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-204-3p與KLF6的3’UTR部分堿基可形成互補(bǔ)配對(duì)，推測(cè)miR-204-3p對(duì)KLF6表達(dá)存在一定調(diào)控作用。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)共轉(zhuǎn)染miR-204-3p抑制WT-KLF6 3’UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性（P＜0.05），對(duì)MUT-KLF6 3’UTR報(bào)告基因的熒光素酶相對(duì)活性無明顯作用（P＞0.05）。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染miR-204-3p組較miR-NC組顯著抑制KLF6蛋白表達(dá)［（0.21±0.03）比（0.46±0.04），P＜0.05］，轉(zhuǎn)染anti-miR-204-3p組較anti-miR-NC組明顯提升KLF6蛋白水平［（0.87±0.08）比（0.43± 0.04），P＜0.05］（F＝259.743，P＜0.001）。見圖5、表5。

表4 抑制KLF6表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的影響/

表4 抑制KLF6表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的影響/

注：KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，NG為正常對(duì)照組，HG為高糖刺激組，HG+si-NC為高糖刺激后給予si-NC干預(yù)組，HG+si-KLF6為高糖刺激后給予si-KLF6干預(yù)組干預(yù)，synaptopodin為肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)蛋白，desmin為結(jié)蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。與NG組比較，aP＜0.05；與HG+si-NC組比較，bP＜0.05

組別NG HG HG+si-NC HG+si-KLF6 F值P值細(xì)胞凋亡率/%7.02±0.71 23.46±2.15a 25.47±2.68 14.69±1.87b 164.495＜0.001重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 KLF6蛋白0.43±0.04 0.86±0.08a 0.88±0.07 0.54±0.05b 120.370＜0.001 synaptopodin蛋白0.75±0.07 0.31±0.03a 0.28±0.03 0.62±0.06b 187.573＜0.001 desmin蛋白0.33±0.03 0.83±0.07a 0.86±0.08 0.49±0.05b 165.286＜0.001 Bcl-2蛋白0.69±0.06 0.29±0.03a 0.27±0.02 0.53±0.05b 197.676＜0.001 Bax蛋白0.32±0.03 0.75±0.07a 0.74±0.06 0.49±0.04b 141.927＜0.001

注：WT-KFL6為野生型KLF6，3’UTR為3’非翻譯區(qū)，miR-204-3p為微小RNA-204-3p，MUT-KLF6為突變型KLF6，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶，a為miR-204-3p陰性對(duì)照，b為miR-204-3p，c為抗miR-204-3p陰性對(duì)照，d為抗miR-204-3p

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-204-3p靶向調(diào)控KLF6的表達(dá)/

表5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-204-3p靶向調(diào)控KLF6的表達(dá)/

注：miR-204-3p為微小RNA-204-3p，KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，miR-NC為miR-204-3p陰性對(duì)照，WT-KFL6為野生型KLF6，MUT-KLF6為突變型KLF6

MUT-KLF6 1.02±0.08 1.00±0.09 0.498 0.625組別miR-NC miR-204-3p t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 WT-KFL6 1.03±0.09 0.41±0.04 18.885＜0.001

2.6 KLF6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的作用HG+miR-204-3p組比HG+miR-NC組顯著降低MPC5細(xì)胞中KLF6蛋白水平（P＜0.05），明顯影響synaptopodin蛋白、desmin蛋白、Bax蛋白、Bcl-2蛋白水平及細(xì)胞凋亡率（P＜0.05），結(jié)果同“2.2”和“2.3”。與HG+miR-204-3p+pcDNA組比較，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6組顯著增加高糖刺激小鼠腎臟足MPC5細(xì)胞中KLF6蛋白表達(dá)量（P＜0.05），顯著減少synaptopodin蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)量（P＜0.05），升高desmin蛋白、Bax蛋白表達(dá)量和細(xì)胞凋亡率（P＜0.05）。見圖6、表6。

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)KLF6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的作用

3 討論

miRNAs長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過與下游靶mRNA的3’UTR發(fā)生特異性結(jié)合，調(diào)控基因表達(dá)，導(dǎo)致mRNA翻譯受到抑制或直接降解miRNA［10］。miRNAs異常表達(dá)與許多疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，包括糖尿病腎?。?1-13］，如miR-770-5p通過靶向TP53調(diào)控足細(xì)胞增殖與凋亡，參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展［14］。Jo等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-204直接靶向胰高血糖素樣肽1受體（GLP1R）3’UTR，miR-204的缺失促進(jìn)胰島GLP1R表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)GLP1R激動(dòng)劑的反應(yīng)，從而改善葡萄糖耐受性，cAMP產(chǎn)生和胰島素分泌，以及對(duì)糖尿病的預(yù)防作用。synaptopodin是一種與肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)的蛋白，可作為足細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志性分子，desmin是足細(xì)胞骨架中間絲蛋白，也是足細(xì)胞損傷的標(biāo)志之一。在高糖刺激條件下，足細(xì)胞中synaptopodin蛋白水平降低，desmin水平提高，二者的異常表達(dá)與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷密切相關(guān)［16］。本研究中，miR-204-3p在高糖刺激的MPC5細(xì)胞中顯著下調(diào)（P＜0.05），miR-204-3p過表達(dá)提升高糖刺激MPC5細(xì)胞中synaptopodin、Bcl-2蛋白水平，降低細(xì)胞凋亡率、desmin、Bax蛋白與cleaved-caspase-3蛋白水平。說明miR-204-3p可以保護(hù)高糖誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞損傷，并抑制細(xì)胞凋亡，與Han等［8］研究結(jié)果一致。

表6 KLF6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的作用/

表6 KLF6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了miR-204-3p過表達(dá)對(duì)高糖刺激小鼠腎臟足細(xì)胞損傷的作用/

注：KLF6為鋅指蛋白Krüppel樣因子6，miR-204-3p為微小RNA-204-3p，HG+miR-NC為高糖刺激后給予miR-204-3p陰性對(duì)照（miR-NC）干預(yù)組，HG+miR-204-3p為高糖刺激后給予miR-204-3p干預(yù)組干預(yù)，HG+miR-204-3p+pcDNA為高糖刺激后給予miR-204-3p+pcDNA干預(yù)組，HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6為高糖刺激后給予miR-204-3p+pcDNA-KLF6干預(yù)組，synaptopodin為肌動(dòng)蛋白微絲偶聯(lián)蛋白，desmin為結(jié)蛋白，Bcl-2為B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關(guān)X蛋白。與HG+miR-NC組比較，aP＜0.05；與HG+miR-204-3p+pcDNA組比較，bP＜0.05

凋亡率/%23.65±2.47 12.41±1.36a 11.05±1.02 18.41±1.67b 103.034＜0.001組別HG+miR-NC HG+miR-204-3p HG+miR-204-3p+pcDNA HG+miR-204-3p+pcDNA-KLF6 F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 KLF6蛋白0.83±0.08 0.39±0.03a 0.37±0.04 0.71±0.07b 138.696＜0.001 synaptopodin蛋白0.29±0.03 0.68±0.06a 0.69±0.07 0.38±0.03b 147.495＜0.001 desmin蛋白0.82±0.08 0.38±0.03a 0.36±0.04 0.68±0.06b 148.224＜0.001 Bcl-2蛋白0.24±0.03 0.57±0.05a 0.58±0.06 0.35±0.03b 128.354＜0.001 Bax蛋白0.77±0.06 0.34±0.03a 0.32±0.03 0.63±0.06b 195.867＜0.001

Krüppel樣因子（Krüppel-like factors，KLFs）是一種高度保守的鋅指蛋白，能結(jié)合特定的DNA基序并調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖、凋亡、分化和代謝［17］。KLF6是KLFs家族成員之一，在前列腺癌、肝細(xì)胞癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中等癌癥中表達(dá)異常［18-19］，在腎臟疾病等的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［20-23］。資料顯示，KLF6糖尿病大鼠模型近端腎小管上皮細(xì)胞中KLF6高表達(dá)［24］。高濃度葡萄糖可誘導(dǎo)人晶體上皮細(xì)胞中KLF6基因表達(dá)上調(diào)［25］。在糖尿病性肺纖維化大鼠模型中，KLF6蛋白和mRNA水平升高，高糖誘導(dǎo)KLF6表達(dá)量增加［26］。本實(shí)驗(yàn)中，高糖刺激明顯促進(jìn)MPC5細(xì)胞KLF6 mRNA和蛋白表達(dá)。抑制KLF6表達(dá)顯著上調(diào)高糖誘導(dǎo)MPC5細(xì)胞synaptopodin及Bcl-2蛋白水平，降低細(xì)胞凋亡率及desmin、Bax蛋白表達(dá)。提示KLF6是高糖刺激足細(xì)胞損傷過程中關(guān)鍵的影響因子。

為了進(jìn)一步觀察miR-204-3p是否通過靶向KLF6來保護(hù)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，采用生物學(xué)信息預(yù)測(cè)結(jié)合雙熒光素酶報(bào)告基因進(jìn)行分析與驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)KLF6是miR-204-3p的靶基因。上調(diào)或下調(diào)miR-204-3p表達(dá)明顯調(diào)控KLF6水平，表明miR-204-3p對(duì)KLF6表達(dá)呈負(fù)調(diào)控作用。此外，KLF6過表達(dá)逆轉(zhuǎn)miR-204-3p過表達(dá)對(duì)synaptopodin及Bcl-2蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用，及逆轉(zhuǎn)miR-204-3p過表達(dá)對(duì)desmin、Bax蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的抑制作用。說明miR-204-3p直接靶向KLF6保護(hù)高糖刺激的小鼠足細(xì)胞損傷，并抑制細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-204-3p通過靶向調(diào)控KLF6，從而保護(hù)高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞損傷，并抑制細(xì)胞凋亡，為糖尿病腎病的診治提供潛在靶點(diǎn)。

（本文圖3見插圖12-4）