馮亞輝 李秀國(guó) 史冬梅

1濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)寧，272001；2濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院耳鼻喉科，山東濟(jì)寧，272001；3濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院皮膚科，濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)真菌實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)寧，272001

毛霉病是毛霉目真菌感染引起的一種致死性真菌感染性疾病。按照感染部位分為鼻腦型、肺型、胃腸型、皮膚型、播散型等，其中鼻腦型毛霉病最為常見。鼻腦型毛霉病是特指毛霉菌通過皮膚黏膜交界處進(jìn)入鼻腔，蔓延至上顎、鼻竇、眼眶，最后因血管侵襲或骨質(zhì)破壞引起顱內(nèi)感染的一種毛霉病。鼻腦型毛霉病臨床表現(xiàn)為鼻部及周邊軟組織為中心的劇烈炎癥，真菌進(jìn)一步侵襲出現(xiàn)血管栓塞、組織壞死，引起一系列癥狀和體征。本病通常急性起病，但也有少數(shù)呈現(xiàn)慢性病程。存在基礎(chǔ)疾病或不正確干預(yù)，本病可迅速進(jìn)展，數(shù)天至數(shù)周即可造成死亡。

1 病原菌

1.1 病原菌概況 毛霉目真菌菌絲發(fā)達(dá)，大多數(shù)腐生，少數(shù)可寄生于人、種子植物或其它真菌上。毛霉病最常見致病菌為根霉、毛霉和橫梗霉屬，其次是根毛霉、小克銀漢霉屬、鱗質(zhì)霉菌屬、瓶霉菌屬[1-3]。筆者根據(jù)全球病原學(xué)薈萃分析結(jié)果繪制致病菌區(qū)域分布圖[4](圖1)，分析發(fā)現(xiàn)根霉屬依舊為世界范圍內(nèi)最常見的毛霉病病原菌，也是鼻腦型毛霉病最常見的致病菌。近年來，由橫梗霉屬與鱗質(zhì)霉屬造成的感染病例在亞歐地區(qū)開始增多[5]。西班牙一家醫(yī)院調(diào)查發(fā)現(xiàn)橫梗霉屬是該區(qū)域毛霉病的主要病原菌[6]；加拿大安大略省的一項(xiàng)區(qū)域回顧顯示，該地鼻腦型毛霉菌病90%是由根霉屬感染所致[7]。我國(guó)毛霉病中常見的致病菌以多變根毛霉(現(xiàn)更名為不規(guī)則毛霉)最為常見，其次為米根霉[8]；但米根霉是鼻腦型毛霉病最常見的病原菌。上述綜合證據(jù)表明毛霉病致病菌種在全球分布既具有統(tǒng)一性，又存在地域間差異。

全球毛霉病的整體病死率為40%～80%，與患者的基礎(chǔ)情況和感染類型有直接相關(guān)性[6,9]。毛霉病的常見分型中鼻腦型毛霉病占比為34%，遠(yuǎn)高于皮膚型(22%)與肺型(20%)。鼻腦型毛霉病發(fā)病初期(1～4周)總體生存率約占確診病例的59.5%，且與患者不同的基礎(chǔ)狀況與接受的治療有關(guān)，面部大面積壞死和神經(jīng)系統(tǒng)受累仍是預(yù)后較差的指標(biāo)(存活率分別為33%和39%)。盡早開始治療對(duì)生存率也有相當(dāng)大的影響，發(fā)病前12天內(nèi)的積極治療生存率可提升至61%，相反未早期治療或未治療患者生存率僅為20%[10]。因此正確診斷、及時(shí)治療顯得尤為重要。

圖1 全球不同區(qū)域毛霉病病原體分布圖

1.2 病原菌的感染途徑 毛霉目真菌多為環(huán)境菌或發(fā)酵菌種，空氣中有孢子分布，患者由于吸入空氣中的孢子而感染。在有易感因素人群中，感染部位存在有利于毛霉菌生長(zhǎng)的微環(huán)境，孢子便可局部定植，菌絲可直接沿血管侵襲或孢子通過血液循環(huán)向周圍組織蔓延。通常先累及鼻腔、鼻甲及口腔、上頜竇、嘴唇等微循環(huán)豐富軟組織，隨后菌絲進(jìn)一步擴(kuò)散侵襲蝶竇、海綿竇、額竇、顱骨底，進(jìn)而感染眼球或顱內(nèi)。

對(duì)于無易感因素人群，報(bào)道的感染途徑主要與損傷有關(guān)，包括外傷(如自然災(zāi)害、機(jī)動(dòng)車事故、戰(zhàn)區(qū)簡(jiǎn)易爆炸裝置或醫(yī)源性損傷)、手術(shù)或燒傷[11-13]。

1.3 病原菌的檢查與鑒定

1.3.1 組織病理學(xué)檢查 通過病理學(xué)檢查診斷真菌感染，則需對(duì)局部切除或穿刺活檢的組織進(jìn)行特殊染色，通常情況下可采用HE、PAS及GMS染色。毛霉菌感染在組織中呈現(xiàn)菌絲結(jié)構(gòu)，HE染色較淡，PAS染色最為清晰，也是首選的染色方法。組織病理學(xué)上，毛霉菌菌絲的寬度可變，為6～16 μm，但也可寬達(dá)30 μm，且無分隔或少分隔。在組織中，菌絲具有不規(guī)則的分枝，但多呈90度分枝[14]。在病理模式中，毛霉菌病病理具有相應(yīng)特征性，在急性起病的感染組織中，可見到出血性梗死、凝固性壞死、血管浸潤(rùn)、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和侵犯神經(jīng)結(jié)構(gòu)等相對(duì)特征性的改變[15-18]。國(guó)外報(bào)道的局灶性慢性鼻腦型毛霉病，其組織病理多表現(xiàn)為以多核巨細(xì)胞為主的慢性肉芽腫性改變，菌絲或孢子結(jié)構(gòu)周圍可見高度嗜酸性物質(zhì)沉積，又稱之為Splendore-Hoeppli現(xiàn)象[19-21]。

但僅僅依靠組織病理學(xué)檢查的方法，診斷毛霉病并不完全可靠，組織病理上不能明確區(qū)分曲霉與毛霉。針對(duì)組織病理進(jìn)行免疫組化檢查[22，23]或利用PCR技術(shù)對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行真菌核酸檢查[24-27]，都具有更高的特異性。

1.3.2 病原菌直接鏡檢及分離培養(yǎng) 直接鏡檢即取病變處分泌物在顯微鏡下直接鏡檢，可使用免疫熒光等快速染色方法，可盡快確認(rèn)患者分泌物中是否有菌絲、孢子等真菌成分[28]。但直接真菌鏡檢的陽性率僅20%。

因此作為黃金診斷標(biāo)準(zhǔn)，病原菌的分離培養(yǎng)至關(guān)重要，對(duì)于后期指導(dǎo)用藥且針對(duì)治療不敏感的病原菌完善藥物敏感試驗(yàn)具有決定性意義。且毛霉目真菌生長(zhǎng)迅速，通過培養(yǎng)分離、鑒定菌種的方法相對(duì)并沒有明顯滯后性。初代培養(yǎng)通常選用沙氏瓊脂培養(yǎng)基，通常建議用新鮮的分泌物或相對(duì)完整組織進(jìn)行培養(yǎng)；但不推薦研磨，因研磨可破壞菌絲結(jié)構(gòu)，不利于真菌生長(zhǎng)。毛霉目真菌適應(yīng)性較強(qiáng)，室溫或37℃均可生長(zhǎng)；菌落為棉花狀或絨毛狀，開始為白色，稍久呈現(xiàn)出暗色或灰黑色，頂端可見孢子囊顆粒。顯微鏡觀察可見特征性的假根、匍匐菌絲、孢子囊、囊軸、囊托、囊領(lǐng)、孢囊梗及孢子囊孢子等結(jié)構(gòu)[29]。

1.3.3 病原菌的分子學(xué)鑒定 相對(duì)于形態(tài)學(xué)鑒定，分子學(xué)方法對(duì)于病原體種屬分類可信度更高。部分學(xué)者認(rèn)為對(duì)于不同病原菌感染所導(dǎo)致的鼻腦型毛霉病而言，其疾病進(jìn)展速度、預(yù)后情況、抗真菌方案的選擇都可能與種屬分類存在相關(guān)性[30-32]。如個(gè)案報(bào)道證實(shí)小克銀漢霉屬感染與預(yù)后不良相關(guān)，且有體外模型支持[33，34]；但目前仍缺乏關(guān)于鼻腦型毛霉病的病原菌種屬與疾病進(jìn)展相關(guān)性的系統(tǒng)性研究報(bào)道。完善的種屬鑒定對(duì)于區(qū)域性的高危人群的發(fā)病預(yù)防及暴發(fā)流行應(yīng)對(duì)都有很高的醫(yī)學(xué)價(jià)值，因此，分子學(xué)鑒定在鼻腦型毛霉病的診療中的地位與價(jià)值必須受到重視。

毛霉目中不同屬真菌鑒定及分類學(xué)研究進(jìn)展不一，但目前內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS序列及28S核糖體亞基序列，即可對(duì)毛霉目真菌進(jìn)行很好的種屬鑒定[35]，種屬鑒定率可達(dá)98%以上，足以滿足臨床鑒定需要。近些年，隨著實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，非傳統(tǒng)的種屬鑒定技術(shù)也逐漸開始應(yīng)用，最具代表性為基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF MS)，隨著該技術(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，對(duì)于鼻腦型毛霉病的致病真菌準(zhǔn)確的種屬鑒定率已經(jīng)可達(dá)到95%以上，體現(xiàn)出了良好的應(yīng)用前景[36，37]。此外，隨著第三代數(shù)字PCR技術(shù)的逐漸推廣，基于數(shù)字PCR技術(shù)的毛霉菌病的鑒定具有廣闊的應(yīng)用和發(fā)展前景。現(xiàn)今，國(guó)內(nèi)外對(duì)于部分真菌感染開展的三代PCR檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)體現(xiàn)出了高敏感性、高特異性的診斷價(jià)值[38，39]。但毛霉菌作為常見的實(shí)驗(yàn)室污染菌，如何確保檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，仍然需要實(shí)驗(yàn)室人員及醫(yī)務(wù)工作者進(jìn)行關(guān)注。

2 易感因素

20世紀(jì)中期，糖尿病逐漸成為鼻腦型毛霉病的主要危險(xiǎn)因素。近年來，化療或免疫抑制劑的應(yīng)用、潛在的惡性淋巴細(xì)胞腫瘤等也成為了毛霉病的重要危險(xiǎn)因素[1，40，41]。如隨著實(shí)體器官和造血干細(xì)胞移植(HSCT)的開展，術(shù)后免疫抑制劑的大量使用，在這些患者群體中相關(guān)病例報(bào)道逐年增多[42]。隨著人們對(duì)真菌免疫研究的進(jìn)一步深入，某些自身的基因缺陷被認(rèn)為與毛霉病的發(fā)病密切相關(guān)，尤其以CARD9基因缺陷為代表。因此對(duì)于無相關(guān)危險(xiǎn)因素的感染患者，考慮其是否具有先天性的基因缺陷十分有必要[43，44]。國(guó)內(nèi)因缺少關(guān)于毛霉菌病的相關(guān)報(bào)道及多中心研究，因此尚未見到相關(guān)流行病學(xué)報(bào)告，但就目前為數(shù)不多的案例報(bào)道來看，免疫缺陷及糖尿病也為我國(guó)常見的易感因素[45-47]。

另外一種相對(duì)特殊類型的鼻腦型毛霉病，可發(fā)生在免疫力正常的人群，感染多由于外傷引起，引起鼻或顏面或周圍其他皮膚慢性感染，病史通常超過3個(gè)月，表現(xiàn)為慢性起病的局部浸潤(rùn)性斑塊、結(jié)節(jié)、輕度破潰結(jié)痂、萎縮性瘢痕形成，緩慢外延。在患處手術(shù)或者其他因素的誘導(dǎo)下，引起深部組織暴露及病原體的深部播散，產(chǎn)生鼻竇等處的深部感染，從而呈現(xiàn)出慢性病程的鼻腦型毛霉菌病[48]。

3 發(fā)病機(jī)制

鼻腦型毛霉病的發(fā)病機(jī)制與病原菌自身特性及宿主均有密不可分的聯(lián)系。另外，部分菌株自身特殊的遺傳突變，對(duì)常規(guī)抗真菌藥產(chǎn)生抗性，也是造成部分病例進(jìn)展迅速的重要原因。

3.1 首先，毛霉目真菌感染人體后，巨噬細(xì)胞的吞噬作用為人體第一道防線。但相關(guān)研究證實(shí)，毛霉目真菌孢子被巨噬細(xì)胞吞噬后可長(zhǎng)期存在于巨噬細(xì)胞內(nèi)，因此可以在感染第一環(huán)節(jié)就形成免疫逃避。相關(guān)動(dòng)物及細(xì)胞模型證實(shí)，這種機(jī)制與毛霉目孢子細(xì)胞壁上的黑色素有關(guān)。這種黑色素對(duì)巨噬細(xì)胞中的亮氨酸氨基肽酶(LAP)與吞噬小體成熟產(chǎn)生抑制作用，同時(shí)可通過持續(xù)激活A(yù)KT/PI3K信號(hào)通路抑制巨噬細(xì)胞凋亡從而獲得持續(xù)的免疫逃避[49]。除此以外，相關(guān)研究證實(shí)，當(dāng)未形成免疫逃避的孢子在患處萌發(fā)后可以迅速誘導(dǎo)募集以巨噬細(xì)胞為主的免疫細(xì)胞凋亡，因此進(jìn)一步加快了毛霉病的進(jìn)展速度[50]。

3.2 人體中存在的多種無機(jī)離子對(duì)于致病真菌的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，鐵離子作為最重要的離子之一，是真菌能量代謝氧化呼吸鏈中參與電子傳遞的鐵硫蛋白的氧化還原中心，豐富的鐵元素可以促進(jìn)真菌繁殖。如糖尿病患者因體內(nèi)酸中毒或鐵利用障礙等疾病，血清轉(zhuǎn)鐵蛋白與游離鐵的結(jié)合能力降低，游離鐵離子升高，進(jìn)而促進(jìn)真菌的繁殖[51,52]。以鼻腦型毛霉病最常見的病原菌根霉屬真菌為例，當(dāng)孢子與免疫細(xì)胞共同孵育時(shí)，其與鐵利用相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，尤其以Fet3和Ftr1為主；Fet3是一種吸收亞鐵所需的多銅亞鐵氧化酶，它與高親和力鐵滲透酶Ftr1相互結(jié)合、相互作用在孢子的鐵同化途徑中發(fā)揮重要作用。同時(shí)在模型中也證實(shí)，與正常巨噬細(xì)胞相比，病原菌感染的巨噬細(xì)胞，其與鐵轉(zhuǎn)運(yùn)及分布相關(guān)的基因(heph、fxn、bdh2、hfe、ltf、lcn2、steap1、steap2和steap4)表達(dá)兩者間存在差異。這證實(shí)了鐵元素在毛霉病中扮演的重要角色，也為針對(duì)毛霉病的螯合鐵治療提供強(qiáng)有利的理論支持[49]。部分菌株因存在細(xì)胞壁鐵結(jié)合受體Fob1和Fob2蛋白基因缺陷，導(dǎo)致無法正常利用鐵元素，可抑制真菌的生長(zhǎng)，因此抑制或拮抗鐵結(jié)合受體蛋白的表達(dá)可能為鼻腦型毛霉病或其他類型毛霉病的治療提供新方法[53]。

3.3 從病原菌的生物學(xué)角度來看，毛霉目為多能量來源真菌，在感染中，毛霉目真菌可以利用患者體內(nèi)豐富的葡萄糖、酮體進(jìn)行能量代謝，因此糖尿病患者且存在酮癥酸中毒為感染高危人群[54]。

3.4 感染宿主個(gè)體因其血糖濃度升高和血清pH值降低，削弱了中性粒細(xì)胞對(duì)菌絲的趨化性和黏附性，高濃度葡萄糖也增加了GRP78(內(nèi)皮細(xì)胞葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，作為毛霉目真菌黏附受體)在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)，幫助病原菌附著和通過血管入侵[55,56]。

3.5 免疫功能低下患者則由于原發(fā)性疾病造成的免疫細(xì)胞數(shù)量減少或功能異常，無法及時(shí)識(shí)別和吞噬并殺滅真菌，造成真菌感染的擴(kuò)散[57]

3.6 在低氧環(huán)境下毛霉目真菌需氧的能量代謝通路相關(guān)基因表達(dá)下調(diào)，利用脂質(zhì)的無氧代謝通路基因表達(dá)上調(diào)，表明毛霉目真菌較其他種屬真菌具有更強(qiáng)的耐低氧繁殖及侵襲性感染能力[58]。

3.7 另外，病原菌自身的毒力及特殊的遺傳突變也是其致病機(jī)制不可忽視的重要部分。吸入的毛霉目孢子進(jìn)一步侵襲性感染首先需要孢子萌發(fā)[59,60]。孢子越大萌發(fā)越快，且具有更強(qiáng)的毒性[61]。研究發(fā)現(xiàn)，孢子大小和鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，均與毛霉目真菌的毒力相關(guān)，在毛霉病動(dòng)物模型中，較大的孢子毒力更強(qiáng)；而鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶A催化亞基CNAA的缺失會(huì)導(dǎo)致更大的產(chǎn)孢量和更強(qiáng)的毒力表型。同時(shí)，G蛋白信號(hào)級(jí)聯(lián)在許多病原真菌的毒力中起著至關(guān)重要的作用，當(dāng)編碼G蛋白α亞基的Gpa11和Gpa12基因功能降低，則會(huì)產(chǎn)生更大體積的孢子[62,63]。在最近的關(guān)于毛霉菌的抗藥研究顯示，當(dāng)部分病原菌接觸到抗真菌藥物時(shí)，它們會(huì)激活一條基于RNAi(RNA干擾)的途徑，迅速產(chǎn)生耐藥突變菌株。特異性阻斷mRNA降解途徑的突變，如基因r3b2和rdrp3中的突變，增加了耐藥表型的產(chǎn)生，類似于rdrp1突變的表型。相反，抑制誘導(dǎo)蛋白(QIP)和類SAD-3解旋酶(RNHA)相關(guān)的突變阻止了耐藥表觀突變體的形成[64]。

4 小結(jié)

鼻腦型毛霉菌病是毛霉目真菌造成的侵襲性真菌感染，進(jìn)展快速，若診斷治療不及時(shí)死亡率極高。鼻腦型毛霉病的病原學(xué)研究及相關(guān)發(fā)病機(jī)制的研究在本病的診療中有十分重要的價(jià)值。病原菌的病理學(xué)檢查、真菌學(xué)檢驗(yàn)及分子鑒定對(duì)于診斷和治療有著非同尋常的意義。因毛霉目真菌為實(shí)驗(yàn)室常見污染菌，如何快速區(qū)分污染還是致病菌仍然是實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)務(wù)工作所面對(duì)的巨大挑戰(zhàn)。另外區(qū)域致病菌種的進(jìn)一步鑒定，致病菌種與其毒力差異研究可能為降低毛霉病，尤其是鼻腦型毛霉病的死亡率提供幫助。