李 楊，周 麗，杜輝輝*，劉玉玲，楊蕊嘉，雷 鳴，鐵柏清

Cd(II)與As(V)在一株土壤細菌sp.上的共吸附研究①

李 楊1, 2，周 麗1, 2，杜輝輝1, 2*，劉玉玲1, 2，楊蕊嘉1, 2，雷 鳴1, 2，鐵柏清1, 2

(1 湖南農(nóng)業(yè)大學資源環(huán)境學院，長沙 410128；2 湖南省灌溉水源水質(zhì)污染凈化工程技術(shù)研究中心，長沙 410128)

本研究利用宏觀批吸附試驗、電位滴定及光譜學手段探討Cd(II) 與As(V)在一株土壤細菌(sp.)表面的共吸附特點和機制。結(jié)果表明：sp. 細菌表面富含羧基、磷?；被土u基等官能團，解離常數(shù)(pa)分別為4.57、7.04、8.22和10.45；當pH<5時，Cd(II) 在復(fù)合體系的吸附量大于單一體系，pH>5時，Cd(II) 在復(fù)合和單一體系吸附量差異不大；在pH 2 ~ 9范圍內(nèi)，As(V) 在復(fù)合體系的吸附量都小于單一體系；細菌表面的羧基和少量氨基參與了Cd、As在細菌表面的絡(luò)合反應(yīng)，且Cd、As會在這些位點發(fā)生競爭作用。本研究證實，土壤pH是影響Cd、As在微生物表面共吸附的重要因素。

土壤細菌；鎘；砷；復(fù)合污染；共吸附

細菌是土壤中數(shù)量最多、分布最廣泛的微生物種群，可占土壤微生物總量的70% ~ 90%[1–2]。細菌及其胞外分泌物(extracellular polymeric substances，EPS)包括糖類、蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)等組分，富含大量官能團[3]，因此對微量金屬元素有很強的吸附能力，并能進一步調(diào)控其生物地球化學循環(huán)過程[4]。近年來，土壤重金屬污染問題日益突出，而微生物在污染土壤修復(fù)領(lǐng)域具有很大的潛力和應(yīng)用前景[5–6]。為進一步制定合理的微生物修復(fù)策略，必須深入理解重金屬元素在細菌表面的吸附和固定機制[7]。

關(guān)于細菌對陽離子如Cd2+、Pb2+、Cu2+的吸附研究已有很多報道。學者普遍認為，細胞壁和EPS表面的羧基、磷酸基、胺基、巰基和羥基等含氧官能團是最主要的吸附位點[8–10]。這些官能團的解離常數(shù)(pa)不同，因此在不同pH下對重金屬的吸附貢獻有較大差異，如Boyanov等[11]報道在pH<4.4時，磷酰基發(fā)揮主導(dǎo)作用，隨著pH升高，羧基的作用更大。此外，重金屬濃度也影響吸附過程，在低濃度時Cd優(yōu)先結(jié)合在巰基上，在中高濃度時Cd主要結(jié)合在羧基和磷酸基上[12]。

相較于研究較多的金屬陽離子，關(guān)于As、Sb等類金屬元素在細菌表面吸附的研究還很缺乏。這主要是因為As、Sb在環(huán)境中多以含氧酸根形式存在，與細菌存在靜電斥力，因此吸附量少，機理表征難度大。但少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)As(III, V)可與紅球菌(sp.)和節(jié)桿菌(sp.)的羧基、羥基和氨基發(fā)生部分絡(luò)合反應(yīng)[13–14]。

重金屬往往以復(fù)合污染形式存在[15]，由于元素特性截然相反，重金屬和類金屬的復(fù)合污染原理非常復(fù)雜，治理難度更大。在我國南方污染區(qū)，Cd、As復(fù)合污染最為典型[16–18]，因此有必要理清Cd、As在土壤膠體界面的共吸附特點和機制。但近年來研究多關(guān)注純礦物體系[19–21]，缺乏Cd、As在微生物體系共吸附行為的認識。

本研究選取一株土壤細菌sp.[22]，該細菌篩選自Cd、As復(fù)合污染土壤，通過批吸附試驗、電位滴定及X-射線光電子能譜探討Cd(II)、As(V)在細菌表面的共吸附特點和機制，探究是否存在協(xié)同或競爭作用，明確Cd、As結(jié)合官能團。本研究結(jié)果對于預(yù)測Cd、As在土壤微界面的化學行為有一定指導(dǎo)意義，為污染土壤的生物修復(fù)提供一定理論支撐。

1 材料與方法

1.1 土壤細菌

本研究所用細菌為一株革蘭氏陰性土壤細菌sp.[22]，分離自湖南省株洲市霞灣地區(qū)某冶煉廠周邊表層土壤(0 ~ 20 cm，pH約為6.5)。該土壤為多金屬復(fù)合污染，Cd、As濃度高達253和147 mg/kg。細菌采用Luria-Bertani營養(yǎng)基(酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH約為7)進行擴大培養(yǎng)至指數(shù)后期，離心(4 000)收集菌體，并用0.01 mol/L NaCl電解質(zhì)洗滌3次后懸浮。取1 ml細菌懸液，在60 °C烘箱中烘干直至恒重，計算細菌懸液的濃度(mg/L)。

1.2 批吸附試驗

Cd、As母液分別由Cd(NO3)2·4H2O和Na3AsO4(分析純)配置。批吸附試驗在一系列50 ml塑料離心管中進行：依次加入一定體積的細菌、重(類)金屬和電解質(zhì)(0.01 mol/L NaCl)溶液，控制總體系為30 ml，最終細菌濃度為0.1 g/L，金屬濃度為0.2 mmol/L。設(shè)置3個體系：單一Cd、單一As以及Cd-As復(fù)合(摩爾比為1)。將懸液pH調(diào)節(jié)為2 ~ 9，并放置于震蕩搖床中反應(yīng)12 h，吸附設(shè)置3個平行。吸附反應(yīng)結(jié)束后，將懸液離心，上清液過0.2 μm濾膜后，用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES)測定Cd、As濃度，初始濃度與平衡濃度的差值計算Cd、As吸附量。收集離心管底部膠狀物，冷凍干燥后，進行X-射線光電子能譜表征。

1.3 表征分析

將新鮮培養(yǎng)的細菌用25 ml/dm2戊二醛原位固定，并用乙醇多級脫水，在掃描電子顯微鏡(SEM，Quanta F250，Germany)上觀察其形貌。

為獲取細菌表面位點種類和濃度，進行自動電位滴定表征。滴定試驗在Metrohmtitrator 836 自動電位滴定儀上進行，滴定前通入氮氣排除滴定杯中的CO2，隨后先用0.1 mol/L HNO3滴定體系pH至3，穩(wěn)定30 min后，再用0.1 mol/L NaOH滴定體系至pH 10左右。利用FITEQL4.0軟件中的非靜電模型(non-electrostatic model)擬合滴定數(shù)據(jù)，獲得官能團種類和濃度。

X-射線光電子能譜(XPS)測定在Thermo ESCA-LAB 250XI電子光譜儀進行。采集C 1s和N 1s高分辨圖譜，用XPSPEAK41軟件擬合 XPS 光譜，C 1s(標準峰位約284.8 eV)用來校正峰位。

2 結(jié)果與討論

2.1 細菌形貌和表面位點

圖1為sp. 細菌的電鏡圖譜，該細菌為桿狀，長度約為2 ~ 3 μm。細菌完整、表面光滑，且沒有明顯的疏松結(jié)合態(tài)胞外分泌物(LB-EPS)，因此重金屬的吸附可能主要發(fā)生在細菌細胞壁表面。

為了獲得細菌表面位點種類和濃度，開展了電位滴定試驗。結(jié)果如圖2所示，橫坐標為pH，縱坐標為質(zhì)子消耗量(total H+，mol/L)，可間接代表細菌的總位點濃度。細菌在pH 3 ~ 10 范圍內(nèi)的緩沖性較強，不同pH點斜率不同，代表細菌表面不同位點(官能團)的質(zhì)子化。我們通過非靜電模型擬合滴定數(shù)據(jù)可知，細菌表面主要有4種位點，分別是羧基、磷?；?、氨基和羥基，其對應(yīng)的pa分別為4.57、7.04、8.22和10.45(圖2)，相似的官能團種類也在其他細菌種類中發(fā)現(xiàn)[8, 23]。對比4個官能團濃度發(fā)現(xiàn)，羥基濃度最高為6.08 mmol/g，氨基最低為0.87 mmol/g，羧基(2.05 mmol/g)和磷酰基(2.52 mmol/g)濃度介于兩者之間。必須指出的是：由于不同位點的解離常數(shù)(pa)不同，因此pH會影響金屬離子與官能團的結(jié)合順序，例如在較低pH時，易解離的羧基可能發(fā)揮主導(dǎo)作用。此外我們發(fā)現(xiàn)，在pH 3時細菌表面電荷量約為–0.001 5 mmol/g，表明細菌的等電點應(yīng)該在pH 3以下。

圖1 Delftia sp. 細菌的掃描電鏡圖譜

圖2 Delftia sp.細菌的電位滴定圖譜及模型擬合

2.2 Cd、As的宏觀吸附

圖3為Cd(II)與As(V)在細菌表面的吸附量隨pH的變化。從總吸附趨勢看，Cd(II) 的吸附量隨pH升高而升高，而As(V)的吸附量隨pH升高而下降。這一趨勢是由離子特性所決定的：在溶液中，Cd(II) 以陽離子(Cd2+)形式存在，而As(V) 以砷酸根陰離子(AsO3– 4)存在，隨著pH升高，吸附體系負電性增加，兩種元素吸附量隨pH變化截然相反。

對Cd而言，當pH<5時，Cd-As復(fù)合體系中的吸附量大于單一體系；當pH>5時，吸附量沒有顯著區(qū)別。其原因可能是：在較低pH時，As(V) 在細菌表面吸附量很大(圖3)，而AsO3– 4的吸附使細菌體系的負電性增加，因此Cd2+與細菌的靜電作用力增強，促進Cd(II) 的吸附；隨著pH升高，Cd(II) 與細菌表面官能團的絡(luò)合作用占主導(dǎo)，因此受靜電力的影響不顯著。與之相反，As(V) 在復(fù)合體系中的吸附量小于單一體系，且在較高pH時更顯著。其原因可能是由于電荷性質(zhì)相反，AsO3– 4陰離子與細菌不存在靜電吸附，可能主要通過絡(luò)合作用結(jié)合，雖然Cd的吸附使體系負電性下降，但對絡(luò)合作用幾乎無影響；在高pH時，Cd與細菌表面位點的親和力可能強于As，從而抑制As吸附。

因此，上述結(jié)果表明只有在強酸(pH<5)環(huán)境中，As(V) 促進微生物吸附Cd(II)，在一般土壤環(huán)境中(pH>5)，As對Cd的吸附幾乎無影響；而Cd抑制 As在微生物上的固定。

(試驗條件：細菌濃度0.1 g/L，金屬濃度為0.2 mmol/L，背景電解質(zhì)為0.01 mol/L NaCl)

2.3 XPS分析

利用X-射線光電子能譜(XPS)分析Cd與As在細菌表面的微觀結(jié)合機制。圖4為sp. 吸附重金屬前后的C 1s高分辨圖譜，碳分為3個主要組分：能量位于約288.0 eV處為C=O/O=C=O，主要包括羧基、酯基；能量位于約286.2 eV處為C-(O, N)，為醇、氨和酰氨；能量位于約284.5 eV處為C-(C, H)，猜測為脂質(zhì)或氨基酸的側(cè)鏈[24–25]。sp. 吸附Cd、As前后不同組分的相對含量(峰面積)發(fā)生了明顯變化，意味著這些組分參與了Cd、As的絡(luò)合反應(yīng)。

圖4 Delftia sp.細菌吸附Cd(II)及/或As(V)前后的C 1s XPS高分辨光譜

Fig. 4 High-resolution C 1s XPS spectra ofsp. before and after binding of Cd(II) and/or As(V)

純細菌在能量約為288.0、286.2和284.5 eV處組分所占比例分別約為11.2%、26.2% 和62.6%(圖4)；當細菌吸附Cd后，三者比例變?yōu)榧s16.4%、36.0% 和47.6%(圖4)，表明羧基和氨基參與了Cd的絡(luò)合；當細菌吸附As后，羧基和氨基組分所占比例也有略微增加，但變化不大，可能主要因為As的吸附量遠小于Cd，造成光譜變化不明顯；當細菌吸附Cd和As后，三者比例變?yōu)榧s16.7%、38.2% 和45.1%，羧基和氨基組分的顯著增加，意味著在Cd、As復(fù)合系統(tǒng)中，羧基和氨基參與了重金屬的吸附。

進一步分析N 1s XPS圖譜，結(jié)果如圖5所示。N主要分為兩類組分，分別是非質(zhì)子化氨基(Nnonpr)，位于約400 eV處，以及質(zhì)子化氨基(Npr)，位于約401.3 eV處。純細菌質(zhì)子化氨基只占2.4%，這主要是因為氨基pa較高，在pH 6.5時只有極少部分產(chǎn)生質(zhì)子化。當細菌吸附Cd、As后，質(zhì)子化氨基組分都有不同程度增加，這意味著少部分氨基參與了Cd、As的絡(luò)合反應(yīng)，進一步驗證了上述C 1s結(jié)果。

2.4 環(huán)境意義

雖然土壤中細菌種類繁多，且有革蘭氏陽性和陰性，它們在細胞壁成分如磷壁酸、肽聚糖、脂多糖組成上有顯著區(qū)別。但已有研究報道，革蘭氏陽性菌和陰性菌在表面官能團組成上有非常高相似性，都富含羧基、氨基、磷酸基、羥基和巰基[3]，這些官能團是重金屬吸附的主要位點。前人也有報道革蘭氏陽性菌(枯草芽孢桿菌)和陰性菌(希瓦氏菌)對Cd的吸附位點相似，都為羧基、磷酸基和巰基[12]，因此本文sp. 細菌結(jié)果可在一定程度上反映一般土壤微生物吸附規(guī)律。此外，雖然sp.細菌與其他已報道的細菌相比，表面EPS較少，但Cd、As在微生物表面的吸附機理差異不會太大，因為EPS也是由多糖、蛋白質(zhì)和核酸組成的大分子物質(zhì)，主要官能團也為羧基、磷酸基和羥基等[26]。因此，EPS只會影響重金屬在微生物表面的吸附量，Cd、As在官能團上的競爭/協(xié)同規(guī)律是不變的。

圖5 Delftia sp. 細菌吸附Cd(II)及/或As(V)前后的N 1s XPS高分辨光譜

Cd、As復(fù)合污染在我國南方污染土壤中極為典型，兩種元素化學特性截然不同，造成它們在土壤膠體界面的化學行為存在顯著區(qū)別。微生物是土壤中典型的有機膠體體系，因此研究Cd、As在微生物體系的共存化學行為有極為重要的意義。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在強酸性土壤中(pH<5)，As促進Cd在細菌表面的固定，因此，單一Cd污染條件下的預(yù)測模型可能低估了Cd在復(fù)合污染土壤中的固定。在我國南方污染區(qū)，特別是部分極酸性的紅壤土，必須考慮這一點。在一般土壤中，特別是表層土壤，pH多大于5，現(xiàn)有的基于單一污染條件模型適用于預(yù)測Cd在復(fù)合污染條件下的化學行為。與之相反，Cd的存在抑制As在微生物體系的固定，因此單一As污染條件下的預(yù)測模型可能高估了As在復(fù)合污染土壤中的固定。

本研究結(jié)果對土壤微生物修復(fù)也有一定的指導(dǎo)意義。根據(jù)吸附試驗結(jié)果，我們估計細菌對重金屬Cd的吸附量可達80 mg/g，要遠強于土壤礦物對Cd的吸附能力(<10 mg/g)[27–28]；在土壤根際微區(qū)，微生物占土壤固相的比例很大，因此在固定Cd并減少向植物體內(nèi)遷移方面有重要作用。而在一般土壤中(pH約4 ~ 7)，由于競爭作用的存在，簡單利用單一微生物修復(fù)Cd、As復(fù)合污染土壤并不是十分奏效，對Cd的效果可能較好，對As的修復(fù)效果可能極差。因此在治理Cd、As復(fù)合污染時，必須考慮研發(fā)基于微生物的復(fù)合材料，如微生物–Fe/Al/Mn氧化物復(fù)合材料，而目前關(guān)于微生物–礦物復(fù)合膠體對Cd、As的共吸附研究還很缺乏，這一點值得進一步關(guān)注。

3 結(jié)論

在sp. 細菌表面，Cd(II)的存在顯著抑制As(V)的吸附；pH<5時，As(V)促進Cd(II)在細菌上的吸附，而pH>5時，對Cd(II) 吸附無影響。細菌表面富含羧基、磷?；?、氨基和羥基等不同pK官能團，而其中羧基和少部分氨基參與了Cd、As的絡(luò)合反應(yīng)，且Cd和As在這些位點發(fā)生競爭作用。預(yù)測Cd、As在復(fù)合污染環(huán)境中的化學行為及治理修復(fù)時，必須考慮pH這一重要因素。

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Co-adsorption of Cd(II) and As(V) to Soil BacteriumSp.

LI Yang1,2, ZHOU Li1, 2, DU Huihui1, 2*, LIU Yuling1, 2, YANG Ruijia1, 2, LEI Ming1, 2, TIE Boqing1, 2

(1 College of Resources and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2 Hunan Engineering &Technology Research Center for Irrigation Water Purification, Changsha 410128, China)

In this study, batch adsorption experiment coupled with potentiometric titration and spectroscopy techniques were applied to investigate the co-adsorption mechanisms of Cd(II) and As(V) to a soil bacteriumsp. The results showed that carboxyl, phosphoryl, amino and hydroxyl groups abound in bacterial surfaces, with dissociation constant (pa) of 4.57, 7.04, 8.22 and 10.45, respectively; Batch results showed that the adsorption of Cd in binary system was larger than that in single system at pH<5, whereas no significant difference was found at pH>5; For As(V), the presence of Cd inhibited as adsorption over the whole pH ranges (2-9). XPS results demonstrated that carboxyl and amine groups participated in the complexation of heavy metals on bacterial surfaces, and Cd and As may compete with each other on the adsorption sites. This study confirmed that soil pH is an important factor affecting the co-adsorption of Cd and As on microbial surface.

Soil bacteria; Cadmium; Arsenic; Combined pollution; Co-adsorption

S153.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2020.05.009

李楊, 周麗, 杜輝輝, 等. Cd(II)與As(V)在一株土壤細菌sp.上的共吸附研究. 土壤, 2020, 52(5): 935–940.

國家自然科學基金項目(41907015)和中國博士后科學基金面上項目(2019M662782)資助。

李楊(1998—)，女，湖南沅陵人，本科生，主要從事土壤污染化學研究。E-mail: 1974389767@qq.com