姚紅麗 姚英武 崔開宇 仝進(jìn)毅 孫麗萍

菟絲子為抗腫瘤復(fù)方藥的主要成分，既往研究已經(jīng)證實(shí)在菟絲子乙醇提取物的單體成分中可以通過直接或間接的方式起到免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等作用[1-2]。目前有關(guān)中藥單體對宮頸癌Hela細(xì)胞抑制的研究較多[3-4]，但是有關(guān)菟絲子乙醇提取物的研究相對較少。本研究旨在評估不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物 人宮頸癌Hela細(xì)胞株購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，菟絲子乙醇提取物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制實(shí)驗(yàn)室制備并提供，生藥濃度為0.3 g/ml。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基與FBS購自上海浩然生物技術(shù)有限公司，MTT試劑盒和細(xì)胞周期檢測試劑盒購自上海優(yōu)予生物科技有限公司，BCA蛋白定量檢測試劑盒與ECL化學(xué)發(fā)光液購自上海恒斐生物科技有限公司，Transwell培養(yǎng)小室購自上海銳賽生物技術(shù)有限公司。兔抗人Caspase-3單克隆抗體、兔抗人Bcl-2單克隆抗體、兔抗人GAPDH多克隆抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗購自北京百奧萊科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菟絲子乙醇提取物的制備 菟絲子乙醇提取物由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥炮制實(shí)驗(yàn)室制備并提供，制備方法為：30 g菟絲子生品藥材經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，過40目篩，稱重定量后放入500 ml的95%乙醇內(nèi)，浸泡30 min，回流提取3次，每次提取60 min，混合3次濾液并過濾得到醇提液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓回收乙醇，隨后在真空環(huán)境下（溫度60℃，真空度0.1 mpa）干燥3～4 d，將得到的乙醇提取物加入100 ml純水溶解，經(jīng)0.2 μm濾菌膜抽提過濾，定容為100 ml放入棕色瓶中，封口膜密封避光保存，生藥濃度為0.1 g/ml。

1.3.2 宮頸癌Hela細(xì)胞的培養(yǎng) 將Hela細(xì)胞置于高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含青霉素100 U/ml、鏈霉素100 μg/ml、10%FBS）中培養(yǎng)，置于恒溫箱 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，當(dāng)細(xì)胞生長密度達(dá)到80%～90%時(shí)，取處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞周期檢測 將培養(yǎng)好的細(xì)胞充分混勻后鋪到96孔板細(xì)胞培養(yǎng)板，分為5組，對照組僅給予1%DMSO，其余4組為實(shí)驗(yàn)組，分別加入3.125、6.25、12.5、25 mg/ml的菟絲子乙醇提取物。收集培育48 h后的各組細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，以1 500 r/min離心10 min，去上清液，PBS洗滌2次，棄上清液，加預(yù)冷乙醇溶液70%振蕩，4℃過夜。再用PBS洗滌1次后室溫條件下加碘化丙啶30 μl/管，染色20 min，最后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。

1.3.4 MTT比色法檢測細(xì)胞增殖能力 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞消化制備單細(xì)胞懸液，以每孔4 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，1個(gè)對照孔；置于恒溫37℃、體積分?jǐn)?shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h。48 h后加入5 mg/ml的 MTT 溶液 10 μl，37 ℃孵育4 h后棄上清液，每孔中加入200 μl DMSO溶解結(jié)晶，12 h后用570 nm波長測定各孔吸光度值，求其平均值。每個(gè)藥物濃度設(shè)平行3孔。細(xì)胞生長的抑制率（%）=（對照組吸光度值-實(shí)驗(yàn)組吸光度值）/對照組吸光度值×100%。

1.3.5 Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn) 收集各濃度菟絲子乙醇提取物處理48 h后的Hela細(xì)胞，制備成1×105個(gè)/ml的單細(xì)胞混懸液。實(shí)驗(yàn)組Transwell上室中加入200 μl的細(xì)胞懸液，下室加入含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出，擦去上室內(nèi)表面細(xì)胞，PBS洗滌3次，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色30 min，蒸餾水沖凈浮色，光鏡（×200）下計(jì)數(shù)至少5個(gè)視野中的穿過濾膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)，以平均細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞遷移能力。將50 mg/L的基質(zhì)膠均勻鋪在Transwell小室的上室底部，過夜干燥，其他步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。光鏡（×200）下計(jì)數(shù)至少5個(gè)視野中穿過濾膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)，以平均細(xì)胞數(shù)表示細(xì)胞侵襲能力。

1.3.6 Western blot檢測細(xì)胞蛋白的表達(dá) 收集各濃度菟絲子乙醇提取物處理48 h后的Hela細(xì)胞，棄培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS清洗3次，加入含有10%蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解液，冰上裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液，使用蛋白提取試劑盒，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度后進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，加入封閉液室溫?fù)u床封閉2 h。次日加入一抗 Caspase-3 單克隆抗體（1∶1 000）、Bcl-2單克隆抗體（1∶1 000）及 GAPDH 多克隆抗體（1∶1 000），室溫孵育 4 h，PBST 洗膜后加入相應(yīng)的二抗（1∶500），室溫孵育2 h。PBST洗膜后，PVDF膜置于膠片上，蛋白面朝上滴加適量的ECL發(fā)光液并迅速放入凝膠成像儀中成像分析測定各條帶面積灰度值，重復(fù)3次，以平均數(shù)表示最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌Hela細(xì)胞的生長曲線及形態(tài)學(xué)觀察 宮頸癌Hela細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”形，前2 d的細(xì)胞量略有降低，可能與部分細(xì)胞死亡有關(guān)。從第3天開始，細(xì)胞進(jìn)入對數(shù)生長期，第7天達(dá)高峰；隨后逐漸降低（圖1a）。給予不同濃度的菟絲子乙醇提取物后，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞貼壁生長，在高倍鏡（×100）下觀察部分Hela細(xì)胞形態(tài)皺縮、個(gè)別細(xì)胞出現(xiàn)破碎或星狀突，細(xì)胞間隙增寬（圖 1b）。

圖1 宮頸癌Hela細(xì)胞的生長曲線（a）及形態(tài)學(xué)觀察（b）

2.2 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞周期的影響 見表1。

由表1可見，宮頸癌Hela細(xì)胞經(jīng)不同濃度菟絲子乙醇提取物作用后，25 mg/ml組G2/M期的細(xì)胞數(shù)比例顯著高于其余各組，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)比例顯著低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。與對照組相比，僅12.5、25 mg/ml組G2/M期的細(xì)胞數(shù)比例顯著增加，G0/G1期細(xì)胞比例下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 不同濃度菟絲子乙醇提取物對Hela細(xì)胞周期的影響（h）

2.3 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響 見表2。

表2 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)增殖抑制率的影響（%）

由表2可見，在培養(yǎng)12 h時(shí)，不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。培養(yǎng)24 h后，25 mg/ml組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率均顯著高于其余各組（均P＜0.05）。3.125 mg/ml組和 6.25 mg/ml組不同時(shí)間點(diǎn)宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。12.5 mg/ml組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率在24、48 h之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但均顯著高于12 h的增殖抑制率（均P＜0.05）。25 mg/ml組宮頸癌Hela細(xì)胞的增殖抑制率隨著時(shí)間的延長顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.4 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響 見表3。

由表3可見，在遷移實(shí)驗(yàn)中，3.125 mg/ml組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組穿透小室的細(xì)胞數(shù)均小于對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。25 mg/ml組穿透小室的細(xì)胞數(shù)均低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

表3 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響（105/ml）

2.5 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響 見表4、圖2。

表4 不同濃度菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

圖2 不同濃度菟絲子乙醇提取物的電泳圖

由表 4、圖 2 可見，48 h 后，12.5、25 mg/ml組的宮頸癌Hela細(xì)胞中促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)均較對照組增加（均P＜0.05），抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)均較對照組降低（均P＜0.05）。其中25 mg/ml組的Caspase-3表達(dá)水平均高于其余各組，Bcl-2表達(dá)水平均低于其余各組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

3 討論

菟絲子在中國被廣泛使用了數(shù)千年，具有抗生殖、改善內(nèi)分泌及雌激素樣作用，除此之外，菟絲子還具有抗衰老、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等諸多作用[5-6]。既往表明，菟絲子可以通過調(diào)節(jié)雌激素受體和黃體生成素受體（luteinizing hormone receptor，LHR）參與下丘腦－垂體－卵巢軸（hypothalamic-pituitary-ovarianaxis，HPOA）軸治療卵巢內(nèi)分泌和生殖功能障礙，對內(nèi)分泌和免疫功能產(chǎn)生影響[6]，而宮頸癌與雌激素密切相關(guān)，但是尚未發(fā)現(xiàn)有菟絲子對宮頸癌的相關(guān)研究。因此，本研究擬通過菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞生物學(xué)行為的影響尋找相關(guān)作用機(jī)制。

以往研究顯示在菟絲子提取物中主要包括黃酮、蘆丁、異鼠李素、少量金絲桃苷和山奈酚等成分。根據(jù)高效液相色譜的結(jié)果，黃酮是主要的活性成分[7-8]。而中藥單體成分中黃酮類物質(zhì)已經(jīng)被廣泛證實(shí)具有抗血管生成、舒張血管、抗細(xì)菌和病毒感染、抗腫瘤等生物活性作用[9-10]。本研究結(jié)果顯示不同濃度的菟絲子乙醇提取物對宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞周期及增殖均有影響，濃度較高的菟絲子乙醇提取物可以將Hela細(xì)胞阻滯在G2/M期，并且增殖抑制率具有隨時(shí)間劑量的依賴性。這與國內(nèi)的部分研究結(jié)果相似[11-12]，郭澄等[11]的研究發(fā)現(xiàn)菟絲子中提取的黃酮成分對腫瘤壞死因子的抑制率達(dá)到18.3%～36.3%，認(rèn)為中藥菟絲子具有抗腫瘤作用。金松等[12]的研究也顯示菟絲子可以有效抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。

本研究結(jié)果顯示菟絲子乙醇提取物能夠以劑量和時(shí)間依賴的方式抑制Hela細(xì)胞的遷移和侵襲能力，這與之前的研究一致[13]。Ray等[13]的研究顯示Hela細(xì)胞通過中藥提取物黃酮成分處理24 h后，通過激活p53和p21使細(xì)胞周期停滯。其中p21過表達(dá)時(shí)可通過與多種細(xì)胞周期蛋白/CDK復(fù)合物的相互作用引起細(xì)胞周期停滯。并且p21作為一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在細(xì)胞應(yīng)激或DNA損傷后被p53上調(diào)。研究也顯示DNA損傷可導(dǎo)致腫瘤抑制蛋白p53水平升高，誘導(dǎo)G1期、G2期或S期細(xì)胞周期停滯，并使DNA修復(fù)發(fā)生[14]，由于p53介導(dǎo)的p21活化是改變癌細(xì)胞生長的關(guān)鍵，因此筆者推測菟絲子提取物對Hela細(xì)胞周期的阻滯可能與Hela細(xì)胞中p53依賴性調(diào)節(jié)有關(guān)[15]。

腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是由一系列涉及細(xì)胞遷移、侵襲和黏附的復(fù)雜過程組成[16]。為了檢測菟絲子乙醇提取物對Hela細(xì)胞的抗轉(zhuǎn)移活性。本研究進(jìn)行了Transwell侵襲和遷移體外試驗(yàn)，結(jié)果顯示與對照相比，高濃度的菟絲子乙醇提取物限制了Hela細(xì)胞的侵襲和遷移。既往研究認(rèn)為MMP-9和MMP-2的抑制可以顯著減少宮頸癌細(xì)胞的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[17]。國內(nèi)研究也顯示中藥成分中的黃酮類成分可以有效抑制MMP-9和MMP-2蛋白的表達(dá)[18]。

既往大量研究顯示細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡相互關(guān)聯(lián)[19]。本研究中還發(fā)現(xiàn)隨著菟絲子乙醇提取物濃度的增加，Hela細(xì)胞中促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)量逐漸上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。眾所周知，Bcl-2家族蛋白和Caspase-3家族蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用，其中Bcl-2家族蛋白成員通過調(diào)節(jié)線粒體外膜通透性來控制線粒體凋亡途徑[20]。Bcl-2的表達(dá)降低時(shí)會導(dǎo)致線粒體膜的去極化，通過激活半胱天冬酶級聯(lián)和釋放細(xì)胞色素C等促凋亡因子導(dǎo)致線粒體基質(zhì)擴(kuò)增，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡[20]。Caspase-3也是凋亡的典型標(biāo)志物，是凋亡過程中的主要終末執(zhí)行酶，在某些與細(xì)胞解體和凋亡體形成相關(guān)的過程中必不可少[21]，研究顯示Caspase-3可以降解多聚ADP-核糖聚合酶等抑制DNA復(fù)制和修復(fù)，并干擾mRNA的剪切，使細(xì)胞表現(xiàn)出染色體固縮，DNA片段化等凋亡特征，進(jìn)而形成凋亡小體[21]。

總之，本研究結(jié)果顯示高濃度的菟絲子乙醇提取物可以通過阻滯細(xì)胞周期于G2/M期，抑制Hela細(xì)胞的侵襲和遷移，通過促進(jìn)Caspase-3上調(diào)和Bcl-2下調(diào)促進(jìn)Hela細(xì)胞凋亡，提示高濃度的菟絲子乙醇提取物有望成為抗宮頸癌藥物的可能。