王榮躍 樓文文 宮劍 黃賢蘋 許張曄

先天性肺囊性腺瘤樣畸形（congenital cystic adenomatoid malformation，CCAM）是一種以肺組織多囊性腫塊伴有支氣管結(jié)構(gòu)增生為特征的病變，病變組織由肺循環(huán)供血，80%位于單側(cè)，20%位于雙側(cè)[1]。CCAM發(fā)病率為1/35 000～1/25 000[2]，男女發(fā)病率相似。產(chǎn)前CCAM可引起胎兒水腫、羊水過多、縱隔移位或消退[3]。染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）技術(shù)可用來檢測染色體微缺失、微重復(fù)[4]，已應(yīng)用于發(fā)育遲緩、智力障礙患兒的診斷[5]和先天性異常胎兒的產(chǎn)前診斷[6-7]，可檢測＞100 k的拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）[8-9]，優(yōu)于傳 統(tǒng) 的 細 胞 遺 傳 學(xué) 核 型 分 析。為探討CNV與CCAM之間的關(guān)系，本研究采用CMA技術(shù)對超聲診斷CCAM的胎兒進行全基因組檢測，從而指導(dǎo)母兒預(yù)后情況的判斷。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2018年3月至2019年12在本院就診的產(chǎn)前超聲診斷胎兒為CCAM的孕婦23例。孕婦年齡17～42（29±5）歲，胎齡17～30+6（19±3）周。根據(jù)胎兒是否合并其他結(jié)構(gòu)異常，分為單純性CCAM 19例和非單純性CCAM 4例。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過，所有胎兒父母均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 胎兒CCAM診斷 產(chǎn)前胎兒CCAM診斷由兩位經(jīng)驗豐富的超聲科醫(yī)師會診確診，必要時行胎兒胸部MRI檢查。

1.2.2 產(chǎn)前診斷方法 超聲檢查提示患有CCAM的胎兒，征得孕婦以及家屬同意并簽署產(chǎn)前診斷知情同意書，采用羊膜腔穿刺術(shù)或臍靜脈穿刺術(shù)取得胎兒標本進行CMA檢測。

1.2.3 DNA提取 采用Qiagen試劑盒（美國Qiagen公司）從臍血（0.5 ml）和羊水（10 ml）中提取基因組 DNA。如需排除母血污染和解釋意義不明的CNV時，則提取父母的外周血標本的基因組。

1.2.4 染色體核型分析 對臍血或羊水進行培養(yǎng)、收獲、染色、滴片后，再行染色體核型分析。

1.2.5 CMA檢測 嚴格按照美國Affymetrix公司提供的標準流程進行操作，對基因組DNA進行消化、擴增、純化、片段化、標記、與芯片雜交、洗滌及芯片掃描，所使用的芯片為全基因組CytoScan 750K芯片（美國Affymetrix公司）。該芯片同時具備單核苷酸多態(tài)性探針和寡核苷酸探針。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用配套的CHAS軟件及相關(guān)的生物信息學(xué)方法分析CMA的檢測結(jié)果，根據(jù)DNA片段拷貝數(shù)的散點圖分布判斷CNV及染色體微缺失、微重復(fù)。根據(jù)文獻及公共數(shù)據(jù)庫分析＞100 kb的CNV的臨床意義，CNV比對分析過程中所參考的數(shù)據(jù)庫包括人類基因組結(jié)構(gòu)變異數(shù)據(jù)庫（DGV）數(shù)據(jù)庫（http://dgv.tcag.ca/dgv/app/）、疾病相關(guān) CNV 數(shù)據(jù)庫（DECIPHER）（https://decipher.sanger.ac.uk/）、人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM）（https://www.omim.org）等。根據(jù)CNV的性質(zhì)不同分為良性CNV、致病性CNV和臨床意義不明確的CNV（variants of uncertain significance，VOUS）。

1.2.7 CNV的驗證 對含有致病性CNV及VOUS胎兒的父母外周血樣本行CMA分析，進一步明確CNV是遺傳還是新發(fā)，協(xié)助判斷CNV的性質(zhì)。

1.2.8 隨訪時間 產(chǎn)前超聲診斷CCAM的胎兒并分娩的，隨訪至出生6個月，了解其出生后CCAM情況。

2 結(jié)果

2.1 產(chǎn)前診斷CCAM胎兒的一般情況 4例非單純性CCAM胎兒合并其他異常，其中合并胎兒生長受限1例，羊水過少2例，心臟移位并羊水過多1例。

2.2 CMA檢測結(jié)果 23例胎兒的基因組均存在CNV，每例胎兒的基因組含有1～5個CNV，片段大小為300 kb～6.20 Mb。3例胎兒檢出致病性CNV，檢出率為13.0%；單純性CCAM胎兒與非單純性CCAM胎兒的致病性CNV檢出率分別為10.5%（2/19）和25.0%（1/4）。3例胎兒相關(guān)情況見表1。17q12微缺失區(qū)段包含腎囊腫和糖尿?。╮enal cysts and diabetes，RCAD）綜合征的關(guān)鍵區(qū)域1.60 Mb的微缺失（圖1）。17p12微缺失區(qū)段包含遺傳性壓力易感性周圍神經(jīng)病（hereditary neuropathy with liability to pressure palsies，HNPP）綜合征的關(guān)鍵區(qū)域1.40 Mb微缺失（圖2）。Xq27.1q28微重復(fù)區(qū)域包含關(guān)鍵基因SOX3基因。經(jīng)過父母驗證后VOUS檢出率為8.7%（2/23），VOUS檢測情況見表 2。

2.3 妊娠結(jié)局情況 19例單純性CCAM胎兒引產(chǎn)1例，分娩18例；4例非單純性CCAM胎兒引產(chǎn)1例，分娩2例，失訪1例，見表3。20例CCAM胎兒出生后經(jīng)過 6個月隨訪，7例（35.0%）自發(fā)消退；5例（25.0%）接受了手術(shù)治療，術(shù)后恢復(fù)良好；8例（40.0%）分娩后CT檢查仍有CCAM，但拒絕手術(shù)仍在隨訪中。

3 討論

2013年美國婦產(chǎn)科協(xié)會（ACOG）建議將染色體微陣列基因芯片技術(shù)分析應(yīng)用于產(chǎn)前診斷，指出若超聲診斷胎兒結(jié)構(gòu)異常并同意行侵入性產(chǎn)前診斷的，用CMA可替代染色體核型分析[10]。Liao等[11]對超聲異常但染色體核型分析正常的446例胎兒中進行CMA檢測，發(fā)現(xiàn)11.4%的胎兒存在致病性CNV。通過CMA檢測可發(fā)現(xiàn)出生缺陷相關(guān)的致病基因，如在先天性食管閉鎖胎兒中通過CMA檢測發(fā)現(xiàn)了GL13基因變異[12]，在骨骼發(fā)育異常的胎兒中通過CMA檢測發(fā)現(xiàn)了PPKAR1A基因、MITF基因變異[13]。本研究使用全基因組CytoScan 750K芯片對23例伴或不伴其他超聲結(jié)構(gòu)異常的CCAM胎兒進行檢測，結(jié)果顯示致病性CNV的檢出率為13.0%，與Deng等[14]報道基本一致。

表1 致病性CNV的CMA檢測結(jié)果

圖1 病例1染色體17q12區(qū)域發(fā)生1.60 Mb的微缺失

圖2 病例2染色體17p12區(qū)域發(fā)生1.40 Mb微缺失

表2 VOUS檢測結(jié)果

表3 CCAM胎兒妊娠結(jié)局情況

本研究顯示單純性CCAM胎兒與非單純性CCAM胎兒的致病性CNV檢出率分別為10.5%和25.0%。單純性CCAM胎兒中發(fā)現(xiàn)的兩個致病性CNV與CCAM的發(fā)生不一定有關(guān)，但有可能是潛在危害健康的原因。

本研究中病例1在17q12染色體上存在1.60 Mb微缺失，與RCAD綜合征（OMIM 137920）相關(guān)。RCAD綜合征是一種常染色體顯性遺傳病，其特征是腎發(fā)育異常（特別是多發(fā)性腎囊腫、腎小球囊性病變、腎發(fā)育不良）和糖尿病[15]。Donnelly等[16]研究中提示17q12微缺失是產(chǎn)前超聲異常中僅次于22q11微缺失綜合征的第二常見的基因芯片異常。RCAD綜合征的發(fā)生與HNF1B（OMIM 189907）基因缺失相關(guān)[16]。Jain等[17]在正常胎兒的肺、肝、胰腺和胃中檢測到HNF1B mRNA，該夫婦經(jīng)過充分的遺傳咨詢后，不愿意接受有可能表現(xiàn)異常的胎兒，回當?shù)蒯t(yī)院引產(chǎn)。

本研究中病例2在17p12染色體上存在1.40 Mb微缺失，與HNPP綜合征（OMIM 162500）相關(guān)，HNPP綜合征表現(xiàn)為復(fù)發(fā)性局灶性運動和感覺性周圍神經(jīng)病[18]，呈常染色體顯性遺傳，輕微外傷可引起局灶性脫髓鞘性神經(jīng)病發(fā)作[19]。該夫婦家庭經(jīng)濟條件差，經(jīng)過充分遺傳咨詢后仍堅決要求引產(chǎn)。本研究中病例3在Xq27.1q28染色體上存在9.53 Mb微重復(fù)，包含SOX3（OMIM 313430）基因，會引起垂體功能下降，經(jīng)過遺傳咨詢后，該夫婦有宗教信仰，要求繼續(xù)妊娠，分娩后予門診隨訪未見新生兒有異常表型，無特殊面容，發(fā)育接近正常同齡兒，仍在隨訪中。

CCAM的預(yù)后主要取決于其在宮內(nèi)是否合并其他相關(guān)畸形。大多數(shù)病變會在出生后的第1年持續(xù)存在，會增加肺部感染的風(fēng)險，Davenport等[20]推薦積極手術(shù)治療。然而，Calvert等[21]發(fā)現(xiàn)在出生后的第1年，CCAM會自發(fā)消退，他們主張對無癥狀嬰兒進行密切隨訪，并對持續(xù)性病變進行再次檢查。本研究中，25.0%（5/20）的胎兒分娩后進行了手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)良好；35.0%（7/20）的胎兒分娩后在生后3～6個月左右病變自發(fā)消退。由于本研究病例數(shù)較少，需要進一步擴大病例數(shù)才能更好得出結(jié)論。但是這個結(jié)果可能有助于增加孕婦繼續(xù)妊娠的信心，尤其是對于那些懷有單純CCAM并且CMA結(jié)果陰性的胎兒孕婦。

綜上所述，CMA技術(shù)能檢出部分致病性CNV，即亞顯微染色體異常，能更好地指導(dǎo)及提高CCAM病變的產(chǎn)前咨詢及管理，避免過度引產(chǎn)。