羌玲玉 湯小星 孫曉暉

(1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，江蘇 南通 226019；2南通市中醫(yī)院介入科；3南通市老年康復(fù)醫(yī)院心內(nèi)科)

研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞損傷、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)等均與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制有關(guān)〔1，2〕。因而探尋動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞損傷機(jī)制可為動(dòng)脈粥樣硬化防治提供新方向。微小RNA(miRNA)作為內(nèi)源性非編碼RNA分子，其可通過調(diào)控基因或信號(hào)通路進(jìn)而參與心腦血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程〔3〕。微小RNA-142-5p(miR-142-5p)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中呈高表達(dá)并可促進(jìn)氧化型密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，但關(guān)于miR-142-5p在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過程中的具體作用機(jī)制尚未完全闡明〔4〕。通過靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)包含轉(zhuǎn)錄激活因子ETS樣蛋白(ELK)1可能是miR-142-5p的靶基因，研究顯示miR-150可靶向ELK1而調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔5〕。相關(guān)研究表明ELK1可保護(hù)皮質(zhì)神經(jīng)元免受缺氧葡萄糖損傷，還可通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而影響細(xì)胞增殖及遷移過程〔6,7〕。ox-LDL誘導(dǎo)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞HAECs中miR-142-5p表達(dá)及其是否通過靶向ELK1影響內(nèi)皮細(xì)胞凋亡還有待驗(yàn)證。本研究通過探討miR-142-5p在ox-LDL誘導(dǎo)的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的調(diào)控作用及其可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與主要試劑 人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。ox-LDL購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自上海博升生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)、胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia公司；LipofectamineTM2000、TRIzol均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-142-5p mimic及陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、miR-142-5p抑制劑(anti-miR-142-5p)、anti-miR-NC均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；ELK1 siRNA(si-ELK1)與陰性對(duì)照siRNA(si-NC)均購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR與反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司；活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2、磷酸化糖原合成酶激酶(pGSK-3β)、總GSK-3β與β-catenin抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司；c-myc抗體購(gòu)自美國(guó)Origene公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的IgG二抗(IgG-HRP)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 -80℃超低溫冰箱保存的HAECs經(jīng)恒溫水浴鍋溶解后，放入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，離心后(800 r/min)接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2)，0.25%胰酶消化后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d收集生長(zhǎng)良好的HAECs接種于96孔板，待細(xì)胞融合至80%左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，應(yīng)用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑分別將anti-miR-142-5p、anti-miR-con、pcDNA、pcDNA-ELK1轉(zhuǎn)染到HAECs中，轉(zhuǎn)染后6 h更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細(xì)胞。

1.2.2ox-LDL處理及分組 用100 μg/ml的ox-LDL刺激HAECs，分別于0、12、24、48 h 時(shí)收集細(xì)胞〔8〕。收集“1.2.1”中轉(zhuǎn)染12 h后的HAECs，用100 μg/ml的ox-LDL分別處理HAECs 24 h，實(shí)驗(yàn)將ox-LDL刺激HAECs分為anti-miR-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+ox-LDL組、pcDNA+ox-LDL組、pcDNA-ELK1+ox-LDL組。為進(jìn)一步驗(yàn)證miR-142-5p與ELK1對(duì)ox-LDL刺激HAECs凋亡的影響，在HAECs中共轉(zhuǎn)染si-ELK1與anti-miR-142-5p，作用12 h后經(jīng)ox-LDL作用24 h，分別為anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)miR-142-5p、ELK1 mRNA表達(dá)水平 TRIzol法提取各組HAECs總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度，取1 μg RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，miR-142-5p、ELK1引物均由美國(guó)Invitrogen公司合成，miR-142-5p以U6為內(nèi)參基因，ELK1以β-actin為內(nèi)參基因，PCR條件為95℃ 5 min，95℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 1 min(循環(huán)40次)，72℃終延伸10 min，根據(jù)qRT-PCR儀自帶軟件分析各孔閾值Ct值，采用2-ΔΔCt法分析miR-142-5p、ELK1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.4Western印跡法檢測(cè)ELK1及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平 收集處理后的HAECs，分別加入放射免疫沉淀(RIPA)裂解液以此提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)測(cè)定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，反應(yīng)結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，脫脂牛奶封閉2 h，分別加入ELK1、Cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2 及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白一抗(1∶1 000)，孵育過夜后分別加入二抗(1∶5 000)，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)進(jìn)行顯影，蛋白均以β-actin為內(nèi)參，置于凝膠成像分析系統(tǒng)分析蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組HAECs，放入離心機(jī)(轉(zhuǎn)速1 000 r/min)離心10 min，棄上清，分別加入200 μl結(jié)合緩沖液，混勻后分別加入5 μl(Annexin V-FITC)和碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育20 min，置于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)生物學(xué)信息網(wǎng)站預(yù)測(cè)miR-142-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-142-5p的靶基因可能是ELK1，分別構(gòu)建野生型ELK1熒光素酶報(bào)告基因載體(WT-ELK1)與突變型ELK1熒光素酶報(bào)告基因載體(MUT-ELK1)，將兩種載體分別與miR-142-5p mimic、miR-con混合后共同轉(zhuǎn)染到HAECs中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞后檢測(cè)細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析，χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1ox-LDL處理時(shí)間對(duì)HAECs凋亡、miR-142-5p和ELK1表達(dá)的影響 與0 h組比較，隨著ox-LDL處理時(shí)間的延長(zhǎng)HAECs凋亡率明顯升高(P<0.05)。HAECs細(xì)胞經(jīng)ox-LDL刺激后miR-142-5p的表達(dá)水平與0 h相比明顯升高，而ELK1 mRNA及蛋白表達(dá)均明顯降低(均P<0.05)。Western印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HAECs經(jīng)ox-LDL刺激后 Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，見表1、圖1、圖2。

表1 ox-LDL不同時(shí)間處理HAECs凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)比較

圖1 流式檢測(cè)HAECs凋亡率

圖2 Western印跡檢測(cè)ELK1蛋白表達(dá)

2.2anti-miR-142-5p抑制ox-LDL處理HAECs凋亡 用miR-142-5p抑制劑(anti-miR-142-5p)轉(zhuǎn)染HAECs細(xì)胞，經(jīng)ox-LDL處理后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HAECs凋亡情況，結(jié)果顯示anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細(xì)胞凋亡率顯著低于anti-miR-con+ox-LDL組(P<0.05)，Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，與anti-miR-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見表2、圖3。

表2 anti-miR-142-5p抑制ox-LDL處理HAECs凋亡和抑制凋亡蛋白的表達(dá)

2.3miR-142-5p靶向ELK1 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-142-5p與ELK1的靶向關(guān)系，結(jié)果顯示miR-142-5p mimic與WT-ELK1共轉(zhuǎn)染后HAECs細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性相較于miR-con與WT-ELK1共轉(zhuǎn)染后HAECs細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而miR-con、miR-142-5p mimic與MUT-ELK1共轉(zhuǎn)染后HAECs細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)，見圖4A、表3。為了驗(yàn)證miR-142-5p與ELK1之間的調(diào)控關(guān)系，采用Western印跡法分別檢測(cè)抑制miR-142-5p表達(dá)及miR-142-5p過表達(dá)后ELK1蛋白表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制miR-142-5p表達(dá)HAECs細(xì)胞中ELK1蛋白表達(dá)明顯升高(anti-miR-142-5p組：0.72±0.05、anti-miR-con組：0.58±0.09，P<0.05)，miR-142-5p過表達(dá)HAECs細(xì)胞中ELK1蛋白表達(dá)明顯降低(miR-142-5p組：0.32±0.04、miR-con組：0.61±0.06，P<0.05)，見圖4B。

1～2：anti-miR-con+ox-LDL組,anti-miR-142-5p+tox-LDL組圖3 Western印跡檢測(cè)HAECs中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

A：miR-142-5p靶向ELK1 3′UTR的序列信息；B：miR-142-5p靶向調(diào)控ELK1蛋白表達(dá);1～4:miR-con組，miR-142-5p組，anti-miR-con組，anti-miR-142-5p組圖4 miR-142-5p靶向調(diào)控ELK1蛋白表達(dá)

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.4過表達(dá)ELK1抑制ox-LDL處理HAECs凋亡 pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細(xì)胞中ELK1蛋白表達(dá)明顯高于pcDNA+ox-LDL組(P<0.05)。pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細(xì)胞凋亡率明顯低于pcDNA+ox-LDL組(P<0.05)；與pcDNA+ox-LDL組相比，pcDNA-ELK1+ox-LDL組HAECs細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 過表達(dá)ELK1抑制ox-LDL處理HAECs凋亡

2.5沉默ELK1逆轉(zhuǎn)anti-miR-142-5p對(duì)ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用 雙抑制ELK1與miR-142-5p表達(dá)后HAECs細(xì)胞中ELK1蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組HAECs細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)水平均顯著升高(均P<0.05)，見表6、圖6。

表6 沉默ELK1逆轉(zhuǎn)anti-miR-142-5p對(duì)ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用

2.6ELK1和miR-142-5p表達(dá)對(duì)ox-LDL處理HAECs中Wnt信號(hào)通路的影響 與anti-miR-con+ox-LDL組相比，anti-miR-142-5p+ox-LDL組HAECs細(xì)胞中p-GSK-3β、β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。進(jìn)一步分析顯示anti-miR-142-5p與si-ELK1共同轉(zhuǎn)染后HAECs中p-GSK-3β、β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，見圖7、表7。

1～2：pcDNA+ox-LDL組,pcDNA-ELK1+ox-LDL組圖5 Western印跡檢測(cè)HAECs中ELK1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

1～4：anti-miR-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-con+ox-LDL組、anti-miR-142-5p+si-ELK1+ox-LDL組；圖7同圖6 Western印跡檢測(cè)HAECs中ELK1蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖7 Western印跡檢測(cè)HAECs中Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 ELK1和miR-142-5p表達(dá)對(duì)ox-LDL處理HAECs中Wnt信號(hào)通路的影響

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，研究顯示內(nèi)皮細(xì)胞損傷是動(dòng)脈粥樣硬化形成的主要因素〔9〕。ox-LDL是引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要作用因子，其可促使單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化形成巨噬細(xì)胞進(jìn)而形成脂質(zhì)斑塊〔10〕。研究表明miRNA可通過調(diào)控靶基因表達(dá)進(jìn)而參與細(xì)胞增殖及凋亡等病理過程〔11〕。

miR-142-5p表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，研究顯示冠心病患者血清中miR-142-5p表達(dá)水平升高并可能參與動(dòng)脈硬化及斑塊形成過程〔12,13〕。徐測(cè)梁等〔14〕研究表明急性冠脈綜合征患者血清中miR-142-5p表達(dá)水平升高且與患者心肌炎癥反應(yīng)及心肌損傷密切相關(guān)。李玉東等〔15〕通過構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化組織中miR-142-5p呈高表達(dá)并可通過抑制靶基因表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。然而，miR-142-5p對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及其可能作用機(jī)制仍未可知，本研究結(jié)果顯示隨著ox-LDL處理時(shí)間的延長(zhǎng)HAECs凋亡率明顯升高，miR-142-5p表達(dá)上調(diào)，而ELK1表達(dá)下調(diào)，Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)明顯升高，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯降低，研究顯示Bcl-2作為抗細(xì)胞凋亡蛋白可參與氧化應(yīng)激所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等過程，Bax可拮抗Bcl-2抗凋亡作用，若Bax同源二聚體增多可促使細(xì)胞凋亡，Bcl-2/Bax失衡可促使線粒體釋放Caspase進(jìn)而引發(fā)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終激活Caspase-3導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，通過檢測(cè)Caspase-3表達(dá)可反應(yīng)細(xì)胞凋亡程度〔16〕。說(shuō)明ox-LDL可能通過促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡進(jìn)而引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化。本研究結(jié)果說(shuō)明抑制miR-142-5p可通過促進(jìn)Bcl-2表達(dá)，抑制Caspase-3、Bax表達(dá)進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。提示抑制miR-142-5p表達(dá)可避免內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

ELK1表達(dá)下調(diào)可通過介導(dǎo)MAPK途徑進(jìn)-而促進(jìn)骨髓瘤細(xì)胞增殖，Ohguchi等〔17〕、Zeng等〔18〕研究表明慢性心房顫動(dòng)患者心肌組織中ELK1表達(dá)下調(diào)。Yan等〔19〕研究表明ELK1表達(dá)異常與小鼠動(dòng)脈粥樣硬化形成有關(guān)。本研究結(jié)果提示上調(diào)ELK1表達(dá)可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs凋亡，抑制ELK1可逆轉(zhuǎn)anti-miR-142-5p對(duì)ox-LDL處理HAECs抑制凋亡作用，miR-142-5p可靶向調(diào)節(jié)ELK1表達(dá)進(jìn)而參與動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程。但miR-142-5p又是通過調(diào)控哪些相關(guān)信號(hào)通路而發(fā)揮作用，研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路激活后可通過促使內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等功能發(fā)生障礙進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生及發(fā)展〔20〕。細(xì)胞處于異常狀態(tài)時(shí)GSK-3β發(fā)生磷酸化形成p-GSK-3β，而p-GSK-3β不能促使β-catenin發(fā)生磷酸化而降解，β-catenin大量聚集可從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中進(jìn)而激活c-myc，促使細(xì)胞凋亡〔21〕。本研究結(jié)果說(shuō)明抑制miR-142-5p表達(dá)可抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活化。miR-142-5p可通過下調(diào)ELK1表達(dá)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而促使內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

綜上所述，miR-142-5p在ox-LDL誘導(dǎo)的HAECs中呈高表達(dá)，而ELK1表達(dá)降低，miR-142-5p可能通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而促進(jìn)HAECs凋亡，為進(jìn)一步研究動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。