朱竹君 祁英杰 于明

(江蘇大學(xué) 1附屬金壇醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 常州 213200；2附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

阿爾茨海默病(AD)又稱老年癡呆，其發(fā)生、發(fā)展及病理改變過程與環(huán)境、遺傳因素等緊密相關(guān)〔1,2〕，但其病理演進(jìn)過程的分子機(jī)制尚不明確。AD是一種神經(jīng)退行性疾病，主要特征為認(rèn)知功能障礙、記憶損害等〔3,4〕。微小RNAs(miRNA/miR)是一類長(zhǎng)18～25 nt、廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物中的非編碼小RNA分子，具有高度保守性，含有與下游靶基因miR的3′非翻譯區(qū)(UTR)互補(bǔ)的堿基序列，可抑制或降解靶基因miR，從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后水平。研究表明，miR異常表達(dá)與腫瘤、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等密切相關(guān)〔5,6〕。多種miR在AD演進(jìn)過程中表達(dá)量異常，參與AD發(fā)生發(fā)展過程〔7,8〕。miR-656-3p在AD演進(jìn)過程中表達(dá)量異常〔9〕，調(diào)控其發(fā)生發(fā)展過程，但miR-656-3p具體的作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究旨在探討miR-656-3p在AD中作用及相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明AD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)及臨床新藥的研發(fā)提供潛在分子靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)主要試劑和儀器 SH-SY5Y細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素、細(xì)胞裂解液、雙熒光報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天公司，胰酶、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，Trizol試劑購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司，Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-656-3p 模擬物及陰性對(duì)照(NC)、anti-miR-432-5p、anti-NC及si-NC和si-ATP10A購(gòu)自上海吉瑪生物有限公司，聚偏氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，兔抗腺苷三磷酸酶(ATP)10A抗體，β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自武漢博士德生物科技有限公司，ATP10A野生型(ATP10A-wt)和ATP10A突變型(ATP10A-mut)熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自廣州銳博生物有限公司。細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，超凈工作臺(tái)購(gòu)自上海博翎有限公司，qPCR儀、PCR儀、酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2細(xì)胞的培養(yǎng)和分組 SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基，含有10%胎牛血清，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，次日更換培養(yǎng)液，待顯微鏡下觀察到SH-SY5Y細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部，加入適量0.25%胰酶消化1～3 min，按1∶3比例傳代培養(yǎng)。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞分為對(duì)照組、模型組、NC組、miR-656-3p組、anti-NC組、anti-miR-656-3p組、si-NC組、si-ATP10A組，對(duì)照組為正常培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，模型組為采用10 μmol/L的淀粉樣蛋白(Aβ25～35)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞構(gòu)建的AD模型細(xì)胞，NC組、miR-656-3p組為模型組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染NC、miR-656-3p模擬物，anti-NC組、anti-miR-656-3p組為模型細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染anti-NC、anti-miR-656-3p，si-NC組、si-ATP10A組為模型細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染si-NC、si-ATP10A。

1.3MTT實(shí)驗(yàn) 收集處于對(duì)數(shù)期的SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度，吸取200 μl細(xì)胞懸浮液接種至96孔板中，每孔含有1×105個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞，將Aβ25～35濃度調(diào)整至0、5、10、20 μmol/L，分別加入各組細(xì)胞中，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，每孔細(xì)胞中加入20 μl無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，小心棄上清，每孔細(xì)胞中加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)孵育10 min，置于酶標(biāo)儀中檢測(cè)每孔細(xì)胞在490 nm處吸光值(OD490 nm值)。

1.4熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR) 將細(xì)胞密度調(diào)整為1.0×103/ml接種至6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)60%～80%，棄去培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞中加入500 μl Trizol溶液，混勻，37℃裂解10 min，提取細(xì)胞中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA為模板，β-actin為對(duì)照，根據(jù)qPCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，反應(yīng)條件設(shè)置為94℃ 3 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 6孔板中每孔接種5×105個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞，各組SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，吸取5 μl陰性對(duì)照及轉(zhuǎn)染質(zhì)粒分別與100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混勻，制備質(zhì)粒稀釋液；5 μl Lipofectamine2000與100 μl無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基混勻，制備Lipofectamine2000稀釋液；將質(zhì)粒稀釋液和Lipofectamine2000稀釋液混合混勻，37℃靜置20 min，形成復(fù)合物；吸取200 μl復(fù)合物加入6孔板中各細(xì)胞中，混勻，37℃培養(yǎng)4～6 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞濃度調(diào)整為1×105/ml接種至6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，吸取500 μl磷脂酰結(jié)合蛋白(Annexin)Ⅴ緩沖液加入每組細(xì)胞，每組細(xì)胞中加入5 μl Annexin Ⅴ-異硫氰酸熒光素(FITC)和5 μl碘化丙啶(PI)，混勻，暗室中孵育30 min，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)各組SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡率。

1.7雙熒光素酶報(bào)告基因 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與miR-656-3p可能結(jié)合的靶基因，發(fā)現(xiàn)ATP10A作為本實(shí)驗(yàn)的候選研究對(duì)象。將購(gòu)買的ATP10A-wt和ATP10A-mut熒光素酶報(bào)告載體分別與過表達(dá)或敲低miR-656-3p共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，收集細(xì)胞，在多功能酶標(biāo)儀中檢測(cè)每孔海腎熒光素酶的信號(hào)及螢火蟲熒光素酶信號(hào)強(qiáng)度，以螢火蟲熒光素酶活性作為參照，統(tǒng)計(jì)比值，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8蛋白質(zhì)印跡(Western印跡)實(shí)驗(yàn) 收集1×107個(gè)SH-SY5Y細(xì)胞，加入500 μl放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液，冰上裂解30 min，提取細(xì)胞中總蛋白。吸取200 μl二喹啉甲酸(BCA)工作液測(cè)定目的蛋白濃度，加入適量4×蛋白上樣緩沖液，100℃加熱5 min促進(jìn)蛋白質(zhì)變性；根據(jù)目的蛋白分子量大小，配制不同濃度聚丙烯酰胺凝膠，置于電泳槽中，加入電泳液，吸取40 μg蛋白樣品分別加入上樣孔，恒壓80 V，電泳至樣品進(jìn)入分離膠，將電壓調(diào)整至120 V，電泳至目的蛋白遷移至凝膠2/3處，停止電泳；取出攜帶目的蛋白的凝膠，割下目的條帶，蒸餾水進(jìn)行清洗，剪取相同大小的聚偏氟乙烯(PVDF)膜，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h；加入一抗稀釋液，4℃孵育過夜；含吐溫20三羥甲基氨基甲烷緩沖液(TBST)洗滌3次×10 min，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次×10 min，加入電化學(xué)發(fā)光(ECL)液孵育，顯影、拍照，Image J軟件分析目的蛋白相對(duì)灰度，重復(fù)3次。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，單因素方差分析及SNK-q檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-656-3p在AD模型細(xì)胞中的表達(dá)量 不同濃度Aβ25～35顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞的增殖(P<0.05)，具有一定的濃度依賴性，在10 μmol/L Aβ25～35作用下SH-SY5Y細(xì)胞的增殖活性變化幅度較大；與0 μmol/L組相比，miR-656-3p在不同濃度Aβ25～35作用的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，其中在10 μmol/L Aβ25～35作用下SH-SY5Y細(xì)胞中變化幅度較大；miR-656-3p的表達(dá)量隨著10 μmol/L Aβ25～35作用時(shí)間的增加顯著降低，在24 h變化幅度較大。見表1。

表1 不同濃度Aβ25～35及10 μmol/L Aβ25～35作用不同時(shí)間對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞增殖活性及miR-656-3p表達(dá)量的影響

2.2過表達(dá)miR-656-3p對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與對(duì)照組(1.000±0.069)相比，模型組、NC組、miR-656-3p組細(xì)胞中miR-656-3p表達(dá)量顯著降低(0.262±0.035、0.271±0.039、0.859±0.078，均P<0.05)；與模型組相比，NC組miR-656-3p的表達(dá)量無(wú)顯著影響；與NC組相比，在細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)染miR-656-3p模擬物可顯著增加miR-656-3p的表達(dá)量(P<0.05)；模型組細(xì)胞較對(duì)照組增殖活性顯著降低、凋亡率顯著增加(P<0.05)，模型組和NC組細(xì)胞的增殖、凋亡無(wú)顯著差異；但過表達(dá)miR-656-3p較NC組顯著增加細(xì)胞的增殖活性(F組間=464.163，P組間=0.000；F時(shí)間=3 831.94，P時(shí)間=0.000；F組間×?xí)r間=157.416，P組間×?xí)r間=0.000)、降低細(xì)胞的凋亡率(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測(cè)

表2 轉(zhuǎn)染miR-656-3p mimics對(duì)細(xì)胞增殖凋亡的影響

2.3miR-656-3p靶基因的預(yù)測(cè)和驗(yàn)證 在線數(shù)據(jù)庫(kù)TargetScan預(yù)測(cè)miR-656-3p與ATP10A 3′UTR部分堿基可互補(bǔ)結(jié)合，提示ATP10A可能是miR-656-3p的下游靶基因；進(jìn)一步通過雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證顯示，與共轉(zhuǎn)染ATP10A-wt和NC/anti-NC載體相比，共轉(zhuǎn)染ATP10A-wt和過表達(dá)miR-656-3p/anti-miR-656-3p載體顯著降低或提高SH-SY5Y細(xì)胞的雙熒光素酶活性(P<0.05)；與共轉(zhuǎn)染ATP10A-mut和NC/anti-NC載體相比，共轉(zhuǎn)染ATP10A-mut和過表達(dá)miR-656-3p/anti-miR-656-3p載體對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中的雙熒光素酶活性均無(wú)明顯的影響。與NC組相比，過表達(dá)miR-656-3p顯著降低ATP10A在AD細(xì)胞模型中的蛋白水平(P<0.05)；相反，下調(diào)miR-656-3p顯著增加ATP10A蛋白水平(P<0.05)。見表3和圖2。

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證miR-656-3p與ATP10A的靶向關(guān)系及蛋白表達(dá)

圖2 miR-656-3p下游靶基因的預(yù)測(cè)及過表達(dá)或下調(diào)miR-656-3p對(duì)ATP10A蛋白水平的影響

2.4下調(diào)ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與0 μmol/L組相比，ATP10A蛋白在不同濃度Aβ25～35作用的SH-SY5Y細(xì)胞中的表達(dá)量顯著增加(0、5、10、20 μmol/L分別為0.126±0.009、0.228±0.013、0.569±0.042、0.731±0.051，P<0.05)；ATP10A蛋白水平隨著10 μmol/L Aβ25～35 作用時(shí)間的增加顯著增加(0、12、24、48 h分別為0.119±0.012、0.259±0.018、0.516±0.037、0.706±0.055，P<0.05)。見圖3。與si-NC組相比，下調(diào)ATP10A顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖(F組間=1 622.468，P組間=0.000；F時(shí)間=10 751.252，P時(shí)間=0.000；F組間×?xí)r間=1 315.756，P組間×?xí)r間=0.000)，抑制其凋亡(P<0.05)，與過表達(dá)miR-656-3p具有相似的作用。見表4。

圖3 下調(diào)ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表4 下調(diào)ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.5過表達(dá)miR-656-3p和ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與NC組相比，miR-656-3p組及miR-656-3p+pcDNA組均顯著降低ATP10A的蛋白表達(dá)量，顯著促進(jìn)細(xì)胞的增殖，顯著抑制細(xì)胞凋亡(P<0.05)；miR-656-3p+ATP10A組較miR-656-3p+pcDNA組顯著增加ATP10A蛋白的表達(dá)量，抑制細(xì)胞增殖(F組間=1 014.546，P組間=0.000；F時(shí)間=11 366.086，P時(shí)間=0.000；F時(shí)間×?xí)r間=288.583，P組間×?xí)r間=0.000)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡(P<0.05)。見圖4和表5。

1～4:NC組、miR-656-3p組、miR-656-3p+pcDNA組、miR-656-3p+ATP10A組圖4 過表達(dá)miR-656-3p和ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

表5 過表達(dá)miR-656-3p和ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6下調(diào)miR-656-3p和ATP10A對(duì)AD模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響 與anti-NC組相比，anti-miR-656-3p組及anti-miR-656-3p+si-NC組均增加ATP10A的蛋白表達(dá)量，抑制細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，差異具有顯著性(P<0.05)；anti-miR-656-3p+si-ATP10A組較anti-miR-656-3p+si-NC組顯著降低ATP10A蛋白的表達(dá)量，促進(jìn)細(xì)胞的增殖(F組間=1 518.042，P組間=0.000；F時(shí)間=2 168.350，P時(shí)間=0.000；F組間×?xí)r間=152.894，P組間×?xí)r間=0.000)，抑制細(xì)胞的凋亡，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表6和圖6。

表6 下調(diào)miR-656-3p和ATP10A對(duì)阿爾茨海默病模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

1～4:anti-NC、anti-miR-656-3p、anti-miR-656-3p+si-NC、anti-miR-656-3p+si-ATP10A圖6 下調(diào)miR-656-3p和ATP10A對(duì)阿爾茨海默病模型細(xì)胞增殖、凋亡的影響

3 討 論

miR在人類基因表達(dá)量的調(diào)控具有舉足輕重的作用，近年來(lái)的研究結(jié)果表明其表達(dá)量與多種疾病其中包括神經(jīng)退行性疾病的演進(jìn)密切相關(guān)。多種miR在心血管〔10,11〕、糖尿病〔12,13〕、腫瘤〔14,15〕、AD〔16〕等的表達(dá)量顯著異常。Bekris等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)AD患者腦組織、腦脊液及血液中miR-15a表達(dá)量下調(diào)。miR-34a在APPswe/PSΔE9模型小鼠中表達(dá)量顯著增加，可能通過調(diào)控Bcl-2參與AD發(fā)生〔18〕。miR-124-3p可以通過靶向下調(diào)Caveolin-1表達(dá)，抑制AD細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞中游離鈣離子濃度，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，為AD防治提供新的思路和靶點(diǎn)〔19〕。miR-153可負(fù)調(diào)控靶基因下游信號(hào)分子糖原合成酶激酶(GSK)-3β的表達(dá)；過表達(dá)miR-153可降低細(xì)胞增殖活性，增加其凋亡水平〔20〕。上述研究結(jié)果均表明miR可通過調(diào)控下游靶基因mRNA的表達(dá)量影響AD的發(fā)生發(fā)展過程。其中，miR-656在神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程發(fā)揮抑制作用，miR-656在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著降低；體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-656可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性生長(zhǎng)，抑制動(dòng)物模型中腫瘤的生長(zhǎng)，其作用機(jī)制主要通過調(diào)控骨形成蛋白受體(BMPR)1A參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)、發(fā)展〔21〕。研究發(fā)現(xiàn)miR-656在AD中的表達(dá)量顯著異常，提示miR-656可能參與AD發(fā)生發(fā)展過程〔9〕。

AD是人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病，研究樣品來(lái)源有限，病因尚不清楚，因此構(gòu)建良好的研究模型具有重要的意義。AD動(dòng)物模型主要有損傷型、自然衰老型、轉(zhuǎn)基因型，每一類動(dòng)物模型均可在一定程度模擬AD的臨床病理特征，但均具有各自的局限性。對(duì)于探究AD分子機(jī)制的相關(guān)研究，細(xì)胞模型優(yōu)于動(dòng)物模型。體外培養(yǎng)的細(xì)胞模型具有簡(jiǎn)單、實(shí)用的特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于AD神經(jīng)毒性機(jī)制研究中。實(shí)驗(yàn)常用的體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞，經(jīng)過Aβ AD進(jìn)行誘導(dǎo)構(gòu)建細(xì)胞模型最常見，是AD較為理想的細(xì)胞模型。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示miR-656-3p在AD中起誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、抑制凋亡的作用，從而抑制AD進(jìn)一步惡化；ATP10A是miR-656-3p的下游靶基因之一，且二者表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)；ATP10A在細(xì)胞模型中表達(dá)量顯著增加，與過表達(dá)miR-656-3p的作用相似，敲低ATP10A可顯著促進(jìn)模型細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞的凋亡，在AD中發(fā)揮保護(hù)作用；共轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-656-3p 和ATP10A顯著恢復(fù)miR-656-3p對(duì)ATP10A蛋白表達(dá)量的抑制作用，逆轉(zhuǎn)miR-656-3p對(duì)細(xì)胞模型增殖的促進(jìn)及細(xì)胞凋亡的抑制作用；相反，共轉(zhuǎn)染敲低miR-656-3p 和ATP10A顯著逆轉(zhuǎn)anti-miR-656-3p對(duì)ATP10A蛋白表達(dá)量的促進(jìn)作用，恢復(fù)anti-miR-656-3p對(duì)細(xì)胞模型增殖的抑制及細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用；表明miR-656-3p調(diào)控AD模型細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡，其作用機(jī)制是直接靶向ATP10A。