唐鳳鸞　郭麗君　趙健　毛世忠

摘要：以走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）健壯瓶苗為試驗(yàn)材料，通過正交設(shè)計(jì)研究了不同基本培養(yǎng)基、不同濃度IAA和NAA及培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)及移栽的影響。結(jié)果表明：（1）在生根培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用的因素是基本培養(yǎng)基，在生根苗移栽中起主導(dǎo)作用的因素是培養(yǎng)材料類型和基本培養(yǎng)基;（2）生根率受影響最大，其次為根長，主根數(shù)最小;（3）走馬胎生根培養(yǎng)最佳組合為1/2 MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽;（4）帶葉莖段可用作走馬胎組培苗生根培養(yǎng)材料，生根率達(dá)88.95%，這與傳統(tǒng)木本植物組織培養(yǎng)生根材料使用頂芽不同，具有一定創(chuàng)新性。本研究技術(shù)能有效提高培養(yǎng)材料使用率，減少藥品用量，降低生產(chǎn)成本，可用于走馬胎種苗規(guī)模化生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：走馬胎;規(guī)模生產(chǎn);生根;材料類型;正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào)： S567.1+90.43? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0030-05

收稿日期：2019-12-20

基金項(xiàng)目：廣西科技計(jì)劃 （編號(hào)：桂科AB16380212）。

作者簡介：唐鳳鸞（1978—），女，廣西桂林人，副研究員，主要從事生物技術(shù)與珍稀瀕危植物保育研究。E-mail：tfl7288@163.com。

通信作者：趙 健，副研究員，主要從事栽培與生物技術(shù)研究。E-mail：358788030@qq.com。

走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）屬紫金?？疲∕yrsinaceae）紫金牛屬（Ardisia）常綠灌木，是我國西南地區(qū)少數(shù)民族常用藥材，主治跌打損傷、風(fēng)濕疼痛等，民間常有“兩腳行不開，不離走馬胎”之說。近年來，隨著人們對植物化學(xué)和藥理作用研究的深入，走馬胎的新功能不斷被發(fā)現(xiàn)，如三萜皂苷類成分對HeLa、MCF-7、BCG-823、EJ、Hepg2 等多種腫瘤細(xì)胞有明顯抑制作用[1-4]，巖白菜素類衍生物能清除逆境產(chǎn)生的自由基，具有較強(qiáng)的抗氧化能力[5]，因此走馬胎越來越受到人們的重視。

走馬胎種子稀少，莖干分枝能力非常弱，利用傳統(tǒng)的播種和扦插方法繁殖種苗難以滿足生產(chǎn)需求。目前有關(guān)走馬胎組織培養(yǎng)的研究已有報(bào)道[6-8]，在生根培養(yǎng)階段，王強(qiáng)等均以不定芽單株為材料，MS為基本培養(yǎng)基獲得生根植株[7-8];而唐鳳鸞等發(fā)現(xiàn)，走馬胎帶葉莖段在以1/2MS為基本培養(yǎng)基的培養(yǎng)配方上也能獲得較好的培養(yǎng)效果[6];然而在木本植物組織培養(yǎng)中普遍認(rèn)為，低濃度的無機(jī)鹽更容易誘導(dǎo)其產(chǎn)生不定根[9-10]，并能減少藥品用量，降低生產(chǎn)成本。筆者在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，利用腋芽繁殖的走馬胎種苗葉片寬厚，莖干粗壯，質(zhì)量好，但由于該物種的頂端優(yōu)勢非常強(qiáng)，即使在組織培養(yǎng)中也基本只有1個(gè)側(cè)芽萌發(fā)，極少出現(xiàn)2個(gè)或以上芽生長，這對木本植物以帶葉頂芽為培養(yǎng)材料進(jìn)行生根誘導(dǎo)的傳統(tǒng)方法非常不利，嚴(yán)重降低了材料的使用效率，不利于生產(chǎn)成本的控制;同時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同方法培養(yǎng)的走馬胎組培苗對移栽管護(hù)技術(shù)要求不同，部分方法雖然能獲得較好的生根率，但植株葉片質(zhì)地薄，角質(zhì)化程度低，極易失水萎蔫，非常不利于移栽，成活率也得不到保障。因此，為了明確培養(yǎng)基成分和各類培養(yǎng)材料對走馬胎瓶苗生根及移栽的影響，提高種苗生產(chǎn)效率并控制成本，本試驗(yàn)研究不同基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料類型及植物生長調(diào)節(jié)劑對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的影響，以期為走馬胎組培種苗的生產(chǎn)提供更實(shí)用的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

用于走馬胎（Ardisia gigantifolia Stapf.）生根培養(yǎng)的材料是由廣西桂林周邊地區(qū)的野生走馬胎植株的幼嫩枝條經(jīng)過啟動(dòng)、增殖培養(yǎng)獲得的，為高度達(dá)6.0 cm以上的健壯瓶苗。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)于2019年1—12月分別在廣西壯族自治區(qū)中國科學(xué)院廣西植物研究所生物技術(shù)中心組培實(shí)驗(yàn)室及育苗大棚內(nèi)進(jìn)行。

1.2.1 不同因素對瓶苗生根培養(yǎng)的影響試驗(yàn)

在前期走馬胎組織培養(yǎng)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取葉片碩大、莖干粗壯、色澤純正的走馬胎組培苗，將其分別剪成帶2張半張葉的頂芽、帶2張半張葉的莖段和無葉莖段3類材料，莖長均達(dá)2.0 cm以上;將3類材料分別接種于含不同基本培養(yǎng)基、不同濃度生長素（IAA）和萘乙酸（NAA）的生根培養(yǎng)基中，采用4因素3水平L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)（表1）。試驗(yàn)共設(shè)9個(gè)處理，每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種15個(gè)材料，重復(fù)3次。

1.2.2 生根培養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)出優(yōu)選培養(yǎng)方案，并通過驗(yàn)證試驗(yàn)及擴(kuò)大生產(chǎn)對優(yōu)選方案進(jìn)行可靠性檢驗(yàn)。驗(yàn)證試驗(yàn)每個(gè)處理接種20瓶，每瓶接種15個(gè)材料，重復(fù)3次;擴(kuò)大生產(chǎn)每個(gè)處理至少接種1 000瓶，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)100瓶。

向培養(yǎng)基中另加30 g/L蔗糖和 6.0 g/L 瓊脂，調(diào)節(jié)pH值為5.5～6.0。分裝后于124 ℃下消毒 22 min。培養(yǎng)室采用日光燈為光源，光照度為40～60 μmol/（m2·s），照射時(shí)間為 12 h/d;培養(yǎng)溫度為（25±2） ℃。

1.2.3 不同條件下培養(yǎng)的生根苗移栽試驗(yàn)

將通過正交試驗(yàn)獲得的生根瓶苗從培養(yǎng)室移到大棚，煉苗7～10 d后取出，清洗干凈培養(yǎng)基，并用甲基托布津50倍液浸泡1～2 min，再移栽于園土、泥炭、珍珠巖體積比為3 ∶1 ∶1的混合基質(zhì)中，在85%蔭蔽度的大棚中培養(yǎng)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

觀測記錄接種50 d后走馬胎瓶苗的生根率、主根數(shù)、平均根長、側(cè)根和莖葉生長情況及生根苗移栽50 d后的成活率。生根率=生根苗數(shù)/接種苗總數(shù)×100%，主根數(shù)為從苗莖基部長出的根數(shù)，平均根長=主根總長度/總根數(shù)，移栽成活率=移栽后成活苗數(shù)/移栽總苗數(shù)×100%。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel、SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對走馬胎瓶苗生根培養(yǎng)的影響

將生根材料接入培養(yǎng)基約1周后莖段基部膨大，2周后可見白色粗壯的不定根形成，此時(shí)腋芽開始萌動(dòng)生長，40 d后形成完整植株。培養(yǎng)50 d后的觀測結(jié)果（表2）表明，各因素對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中根系誘導(dǎo)和莖葉生長的影響差異較大。1號(hào)處理至6號(hào)處理生根率高、主根數(shù)量多、側(cè)根發(fā)達(dá)、根系生長均勻，且莖葉生長良好，色澤純正（圖1）;9號(hào)處理雖然植株生根率達(dá)97.78%，但根數(shù)少，根系弱，莖干細(xì);7號(hào)處理和8號(hào)處理不僅生根率低，分別只有68.52%和58.89%，而且根莖葉整體生長效果差。

2.2 不同條件下走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的統(tǒng)計(jì)分析

對觀測結(jié)果進(jìn)行極差分析可知（表3），各因素對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中生根率的影響大小順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基>培養(yǎng)材料類型>NAA>IAA，對主根數(shù)量的影響大小順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基> IAA>NAA >培養(yǎng)材料類型，對平均根長的影響大小順序?yàn)榛九囵B(yǎng)基>NAA>IAA>培養(yǎng)材料類型;其中基本培養(yǎng)基對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的影響最大，IAA、NAA、培養(yǎng)材料類型3個(gè)因素對生根率和主根數(shù)量的影響接近。進(jìn)一步進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示，4個(gè)測試因素對生根率的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01，F(xiàn)0.01=8.02），基本培養(yǎng)基和NAA對平均根長的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01，F(xiàn)0.01=8.02），僅基本培養(yǎng)基對主根數(shù)量的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01，F(xiàn)0.01=8.02）。由此可見，基本培養(yǎng)基類型在走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用。

對各因素不同水平培養(yǎng)條件下的植株生根率、平均主根數(shù)量和根長進(jìn)行多重比較分析，結(jié)果（表3）發(fā)現(xiàn)，使用不同基本培養(yǎng)基培養(yǎng)的效果差異顯著（P<0.05），當(dāng)基本培養(yǎng)基為1/2MS時(shí)有利用走馬胎組培苗生根培養(yǎng)，其生根率、主根數(shù)量和平均根長均最大;其次為MS，除主根數(shù)量與1/2MS差異顯著外（P<0.05），其他培養(yǎng)效果與1/2MS接近;1/2MS+5 mg/L 維生素B2培養(yǎng)效果最差，對應(yīng)生根率、主根數(shù)量和平均根長分別只有75.06%、1.21條和2.67 cm。不同濃度NAA對生根率和平均根長的培養(yǎng)效果差異顯著（P<0.05），當(dāng)NAA濃度為10 mg/L時(shí)有利于走馬胎組培苗根系誘導(dǎo)及伸長，生根率和平均根長分別為98.70%、4.29 cm，其次為1.5 mg/L;不同濃度IAA和培養(yǎng)材料類型對生根率的影響差異也達(dá)顯著水平（P<005），其中 2.0 mg/L IAA和頂芽的培養(yǎng)效果最好，生根率分別為98.52%、98.86%;IAA、NAA和培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗主根數(shù)量的影響差異不明顯。

從分析結(jié)果可以看出，根據(jù)走馬胎組培苗生根培養(yǎng)中生根率、平均根長各因素的最佳水平為 1/2MS、2.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、頂芽，根據(jù)主根數(shù)量各因素的最佳水平為1/2MS、1.0 mg/L IAA、1.0 mg/L NAA、帶葉莖段。但在植物組織培養(yǎng)中，當(dāng)組培苗根系生長正常時(shí)，其生根培養(yǎng)的主要考核指標(biāo)為生根率和根條數(shù)，又因2.0 mg/L IAA、頂芽與1.0 mg/L IAA、帶葉莖段對生根率影響差異顯著（P<005），而對平均主根數(shù)量效果差異不明顯（P>005），故綜合考慮植株根系及莖葉生長情況、主效因素等認(rèn)為，1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽為走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的最佳組合;帶葉莖段的生根率和主根數(shù)量分別達(dá)88.95%和3.20條，均處于較好水平，也可用作走馬胎組培苗生根培養(yǎng)。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)及擴(kuò)大生產(chǎn)結(jié)果

在正交試驗(yàn)基礎(chǔ)上，對1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA+頂芽的生根組合（組合1）及以1/2MS+2.0 mg/L IAA+1.0 mg/L NAA為生根培養(yǎng)基接種帶葉莖段（組合2）的實(shí)際培養(yǎng)效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果在驗(yàn)證試驗(yàn)中，組合1的生根率為10000%、主根數(shù)量為4.95條，組合2的生根率為92.80%、主根數(shù)量為4.24條;在擴(kuò)大生產(chǎn)中，組合1的生根率為95.6%、主根數(shù)量為4.18條，組合2的生根率為89.67%、主根數(shù)量為4.35條。可見以1/2MS+2.0 mg/LIAA+1.0 mg/L NAA為生根培養(yǎng)基時(shí)，頂芽和帶葉莖段均可用于走馬胎組培苗生根培養(yǎng)。

2.4 不同因素對走馬胎生根苗移栽的影響

由表2可知，不同因素組合處理培養(yǎng)的走馬胎生根苗在移栽環(huán)節(jié)成活率差異較大，其中7號(hào)處理移栽成活率為100%，1、5、6、9號(hào)等4個(gè)處理的成活率均達(dá)95%及以上，2號(hào)和3號(hào)處理成活率較低，分別僅為66.43%和43.97%。極差和方差分析結(jié)果表明，各因素對走馬胎組培生根苗移栽成活率的影響大小順序?yàn)榕囵B(yǎng)材料類型>基本培養(yǎng)基> IAA>NAA，且材料類型和基本培養(yǎng)基的影響達(dá)顯著水平（P<0.05）（表4）。對各因素中不同水平間的成活率進(jìn)行多重比較分析（表4），發(fā)現(xiàn)在不同的基本培養(yǎng)基、培養(yǎng)材料類型和IAA濃度下差異顯著（P<005），其中MS、1/2MS、頂芽、帶葉莖段及1.0 mg/L IAA的效果較好。這與生根培養(yǎng)和驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果相呼應(yīng)，進(jìn)一步說明試驗(yàn)結(jié)果具有可靠性。

3 結(jié)論與討論

從觀測結(jié)果看，不同培養(yǎng)材料類型對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的外觀生長影響差異較明顯，其中以頂芽和帶葉莖段為材料培養(yǎng)形成的生根植株葉片寬厚、健壯，且數(shù)量較多;以無葉莖段培養(yǎng)的生根植株不僅葉片質(zhì)地薄、葉面積小，而且數(shù)量也少。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)材料類型可極顯著影響走馬胎組培苗的生根率（P<0.01，F(xiàn)0.01=8.02），生根率大小表現(xiàn)為頂芽>帶葉莖段>無葉莖段，但對主根數(shù)量和平均根長的影響差異不明顯。鑒于頂芽和帶葉莖段對走馬胎組培苗生根培養(yǎng)的整體影響，而且?guī)~莖段的生根率也可達(dá)88.95%，因此在實(shí)際生產(chǎn)中可將較高的不定芽剪成符合要求的頂芽和帶葉莖段進(jìn)行生根培養(yǎng)，從而提高材料的利用率。