俎天嬌　喬瀟　張小芳　張鍇　 喬亞科　李桂蘭

摘要：為獲取干旱脅迫狀態(tài)下的bHLH家族相關(guān)基因，以30 d苗齡的野生大豆為試驗(yàn)材料，澆灌20% PEG-6000模擬干旱脅迫，分別在干旱處理后0、6、12、24、48 h取樣提取葉片RNA并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。以基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)（GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG）、NCRI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（NR）注釋的結(jié)果為基礎(chǔ)，以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，再綜合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的相關(guān)數(shù)據(jù)，共獲得177條相關(guān)序列，包括64個(gè)bHLH家族成員。通過(guò)蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析確定了4個(gè)干旱相關(guān)基因。為進(jìn)一步研究野生大豆干旱脅迫下bHLH家族抗旱基因提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：野生大豆;轉(zhuǎn)錄組;干旱脅迫;bHLH;顯著差異表達(dá)基因;轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類(lèi)號(hào)：S565.101 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0024-06

收稿日期：2019-11-29

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C2019407006）;國(guó)家轉(zhuǎn)基因重大專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：2014ZX0800404B）。

作者簡(jiǎn)介：俎天嬌（1997—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事植物遺傳資源及植物分子生物學(xué)研究。E-mail：947119850@qq.com。

通信作者：李桂蘭，博士，教授，主要研究方向?yàn)樽魑镞z傳資源及作物基因工程。E-mail：lgl63@126.com。

干旱脅迫是植物普遍存在的非生物脅迫之一[1]，栽培大豆是豆類(lèi)作物中對(duì)缺水最敏感的一種，缺水對(duì)栽培大豆產(chǎn)量和品質(zhì)會(huì)產(chǎn)生巨大影響[2]。野生大豆在抗逆性方面要優(yōu)于栽培大豆，較栽培大豆具有更多的抗逆基因[3-4]，為栽培大豆抗旱育種提供了重要的種質(zhì)資源。

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是真核生物中廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，對(duì)真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝和逆境脅迫等方面均有作用[5]。該家族基因成員較多，多數(shù)研究都是針對(duì)整個(gè)家族進(jìn)行開(kāi)展的[6]，目前除熟知的模式生物和作物[6-9]外，在黃芩[10]、沙冬青[11]、櫻桃[12]中也有研究，但在豆科植物中的研究[13]尤其是逆境脅迫下的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的報(bào)道較少。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)獲取差異表達(dá)基因已成為一種新的研究方法[14-17]，目前，已從不同研究角度對(duì)大豆或野生大豆基因進(jìn)行了挖掘與分析[18-19]。本研究以30 d苗齡的野生大豆為材料，對(duì)全轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序，以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，并結(jié)合測(cè)序公司的轉(zhuǎn)錄因子分析結(jié)果，從功能注釋、蛋白進(jìn)化和互作等角度對(duì)序列進(jìn)行分析，探討bHLH轉(zhuǎn)錄因子與干旱之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試野生大豆的種子采自河北省東部沿海地區(qū)昌黎縣，試驗(yàn)所用材料為野生大豆永46的30 d苗齡幼苗;聚乙二醇（PEG6000）購(gòu)自天津博美科生物技術(shù)有限公司。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

在野生大豆苗齡達(dá)30 d時(shí)，取未處理（0 h）及加入20% PEG-6000處理后6、12、24、48 h的同一個(gè)葉位復(fù)葉，并提取葉片總RNA。所得RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后送至深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，具體步驟參考張小芳等的方法[20]。

1.3 功能注釋及ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白關(guān)鍵詞搜索

將測(cè)序結(jié)果通過(guò)BLAST比對(duì)到公共數(shù)據(jù)庫(kù)，包括NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（NR）、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)（GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)（KEGG），之后以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選，綜合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的數(shù)據(jù)，最終獲得bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族的相關(guān)序列信息。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

String（https：//string-db.org/）是研究蛋白-蛋白作用的在線生物網(wǎng)站。將表達(dá)差異基因?qū)朐摼W(wǎng)站，獲得蛋白互作數(shù)據(jù)，再通過(guò)Cytoscape對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因簇注釋信息

以bHLH轉(zhuǎn)錄因子為關(guān)鍵詞對(duì)獲得的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子分析中提供的數(shù)據(jù)，共獲得了177條基因簇。這些基因簇的表達(dá)量FPKM值介于0～143.6之間，表達(dá)量在0～1 282.31之間。具體注釋情況見(jiàn)表1。這些被注釋的基因簇中，在GO中，被注釋到細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程中的分別有10、38、11條;在與NR比對(duì)時(shí)，只有10條基因簇?zé)o注釋。

2.2 bHLH轉(zhuǎn)錄因子顯著差異表達(dá)基因統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)顯著差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）的上調(diào)表達(dá)及下調(diào)表達(dá)情況可以了解樣本間的差異概況。對(duì)獲取的基因簇信息進(jìn)行差異表達(dá)基因篩選，這些差異表達(dá)基因在不同處理時(shí)間點(diǎn)的兩兩對(duì)比情況見(jiàn)表2。以未處理材料作為參照，上/下調(diào)基因隨處理的時(shí)間延長(zhǎng)而減少。

2.3 bHLH轉(zhuǎn)錄因子顯著差異表達(dá)基因功能分析

2.3.1 GO功能分析

GO富集分析可將差異表達(dá)基因分為3類(lèi)。由圖1可知，差異表達(dá)基因分屬于2個(gè)細(xì)胞組分、7個(gè)分子功能和16個(gè)生物學(xué)過(guò)程中，主要富集于胞內(nèi)帶膜細(xì)胞器（9個(gè)）、結(jié)合蛋白活性上（30個(gè)）。生物學(xué)過(guò)程的注釋項(xiàng)目最多，且各注釋項(xiàng)目分布較離散，富集因子在3個(gè)以上的僅有細(xì)胞形態(tài)建成、轉(zhuǎn)錄、激素響應(yīng)、紅光和遠(yuǎn)紅光響應(yīng)以及分生組織分化。

2.3.2 KEGG富集分析

KEGG可以把從已經(jīng)完整測(cè)序的基因組中得到的基因目錄與更高級(jí)別的細(xì)胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來(lái)。

基于KEGG富集分析，共建成了4條通路，分別為K10798（poly[ADP-核糖]聚合酶）、K10863（aprataxin，APTX）、K12126（光敏色素作用因子3）和K13422（轉(zhuǎn)錄因子MYC2），各通路包含的差異基因數(shù)量分別為1、22、45、73個(gè)。包含注釋基因最多的K13422同時(shí)參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（圖2）和絲分裂原活化蛋白激酶途徑（圖3），主要參與了單萜類(lèi)生物合成、吲哚生物堿的生物合成、衰老、防御反應(yīng)、傷害刺激和根部生長(zhǎng)等過(guò)程。

2.3.3 NR聚類(lèi)分析

NR即非冗余蛋白庫(kù)，在該數(shù)據(jù)庫(kù)中有注釋差異表達(dá)基因可以獲得對(duì)應(yīng)的蛋白序列數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)蛋白序列進(jìn)行匯總，可以按該數(shù)據(jù)庫(kù)有注釋的差異表達(dá)基因?qū)⒌鞍追譃?4個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員。用鄰接法對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，可將具有蛋白序列注釋的基因分為64個(gè)分類(lèi)（圖4）。在這些分類(lèi)中，自成1類(lèi)的包括BEE3、bHLH35、bHLH149、bHLH90、bHLH128，除此之外，還有15個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員的注釋為1個(gè)，但未單獨(dú)分類(lèi);bHLH25和bHLH18的注釋超過(guò)10個(gè)，但由于蛋白存在不同的亞型，并非所有的同一家族成員都聚在一類(lèi)中;bHLH36與MYC2聚在一類(lèi);bHLH47與bHLH66、bHLH82聚在一類(lèi);bHLH67和bHLH70聚在一類(lèi);bHLH84與bHLH71聚在一類(lèi);bHLH91與CBF3聚在一類(lèi);bHLH111與bHLH130聚在一類(lèi);bHLH120與bHLH131聚在一類(lèi);bHLH126與bHLH18聚在一類(lèi);bHLH143與bHLH086聚在一類(lèi);bHLH144與bHLH13聚在一類(lèi);bHLH147與bHLH140聚在一類(lèi);bHLH148與bHLH106聚在一類(lèi);其他參與注釋的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員還包括bHLH3、bHLH122、bHLH30、bHLH135、bHLH93、bHLH87、bHLH68等。

2.4 bHLH轉(zhuǎn)錄因子差異基因蛋白互作分析

為了進(jìn)一步從蛋白水平對(duì)bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能和調(diào)控作用進(jìn)行研究，構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖5）。在眾多差異表達(dá)基因中，有15個(gè)存在蛋白互作關(guān)系，根據(jù)互作網(wǎng)絡(luò)的作用關(guān)系，從中選出了GLYMA01G23230.1（FAMA）、GLYMA08G36590.1（bHLH71）、GLYMA09G33730.2（MYC2）、GLYMA17G10740.1（bHLH47）這4個(gè)蛋白，可將其對(duì)應(yīng)的基因作為干旱脅迫的候選基因。

3 討論與結(jié)論

bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族是植物第二大類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子家族[21]，具有典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，不僅參與了植物體內(nèi)氣孔發(fā)育[22]和激素信號(hào)傳導(dǎo)[23]等過(guò)程，而且在植物響應(yīng)干旱[24]、高鹽[25]、脫落酸（ABA）[26]、缺鐵[27]和低溫[28]等非生物脅迫過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。如AtbHLH122顯著受干旱的誘導(dǎo)[29]，AtbHLH68參與擬南芥體內(nèi)ABA的合成[30];Ghb HLH130在逆境脅迫條件下，顯著受干旱和ABA脅迫的誘導(dǎo)[31]，OsbHLH148[32]、PebHLH35[33]的過(guò)表達(dá)增加了植物的耐旱性。

FAMA是氣孔發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控氣孔母細(xì)胞的分裂。FAMA突變體會(huì)產(chǎn)生不成熟的氣孔，進(jìn)而影響氣孔的閉合，對(duì)水分的控制能力減弱[33];在對(duì)干旱條件下的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AMA可以同時(shí)與bHLH71、bHLH93互作，bHLH71和bHLH93之間也有互作;目前對(duì)bHLH71尚未見(jiàn)報(bào)道，推測(cè)bHLH93與甾醇合成有關(guān)[9]，具體功能機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

MYC2是MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子中研究最深的，在植物受到環(huán)境脅迫時(shí)，一方面，可以啟動(dòng)JA基因的表達(dá)，另一方面，有研究表明，MYC2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于植物抗氧化能力發(fā)揮重要的正調(diào)控作用[34-35]。在本研究中，注釋到的MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在模擬干旱處理12 h時(shí)表達(dá)量變化倍數(shù)最多的可達(dá)7倍以上，最少的也可達(dá)2倍，且MYC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子間存在相互作用。

另外1組存在蛋白互作的轉(zhuǎn)錄因子是bHLH47與bHLH104。在蛋白序列聚類(lèi)分析時(shí)，bHLH47與bHLH66、bHLH82聚在一類(lèi)，目前關(guān)于bHLH47的報(bào)道尚不多見(jiàn)，Bruex等對(duì)擬南芥根表皮細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析時(shí)，同時(shí)注釋到了bHLH66和bHLH82，發(fā)現(xiàn)它們對(duì)根毛伸長(zhǎng)有重要作用[36]。對(duì)bHLH104的研究報(bào)道主要集中在金屬鎘脅迫[37]和調(diào)控鐵平衡[38]方面，關(guān)于其干旱脅迫響應(yīng)功能尚未見(jiàn)報(bào)道。

野生大豆永46在干旱脅迫下差異表達(dá)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族基因豐富，本研究共獲得177條相關(guān)序列，包括64個(gè)bHLH家族成員。在處理 6 h 時(shí)，注釋的差異表達(dá)基因最多，且差異在5倍以上基因最多;在GO分析中，生物學(xué)過(guò)程注釋最為豐富;通過(guò)進(jìn)一步的蛋白進(jìn)化樹(shù)和蛋白網(wǎng)絡(luò)互作分析最終得到4個(gè)候選基因。

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