李全勝　武冬梅　陳云　王國棟　梁飛

摘要：通過優(yōu)化生防芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件，以提高其搖瓶水平上發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)量，為其進一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供技術(shù)支撐。在搖瓶水平上，首先采用單因素試驗研究不同的發(fā)酵時間、初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速、接種量和裝液量等發(fā)酵條件對生防芽孢桿菌S12芽孢數(shù)量、菌體數(shù)量和產(chǎn)率的影響，隨后采用正交試驗優(yōu)化確定各發(fā)酵條件的最佳組合。生防芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢的最適發(fā)酵條件為：裝液量80 mL/250 mL、接種量3%、初始pH值7.0、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、時間84 h。發(fā)酵條件優(yōu)化后，搖瓶水平上S12菌株的芽孢數(shù)量、菌體數(shù)量分別達到5.721×109、5.822×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率為98.28%。正交試驗優(yōu)化后的發(fā)酵條件提高了S12菌株的芽孢產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，為其進一步生防菌劑的生產(chǎn)和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：生防芽孢桿菌;芽孢產(chǎn)量;發(fā)酵條件;正交試驗

中圖分類號： S435.621;S182? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0119-06

收稿日期：2019-11-21

基金項目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計劃（編號：2016AD029、2016AC008）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團中青年領(lǐng)軍人才計劃（編號：2018CB026）;國家重點研發(fā)計劃（編號：2016YFD02004005-4、2017YFD0201506）。

作者簡介：李全勝（1986—），男，山東齊河人，碩士，助理研究員，主要從事土壤微生物發(fā)掘及利用研究。E-mail：moucheng2005@126.com。

通信作者：梁 飛，博士，副研究員，主要從事土壤肥料與滴灌技術(shù)研究。E-mail：liangfei3326@126.com。

我國棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）引起的一種毀滅性種傳和土傳性病害，俗稱“棉花癌癥”[1-2]。大麗輪枝菌寄主廣泛，達600多種，主要是錦葵科、豆科、十字花科和茄科等雙子葉植物，且易受環(huán)境和寄主變化的影響而產(chǎn)生新的生理型，并且形成的微菌核在土壤中存活時間達十幾年，給防治工作造成了巨大的困難[3-4]。目前，國內(nèi)外對棉花黃萎病的防治主要采用輪作倒茬、選育抗病品種、化學(xué)防治和生物防治等手段，其中生物防治具有環(huán)境友好、綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生抗性、發(fā)展?jié)摿Υ蟮葍?yōu)勢而備受大家關(guān)注和青睞[5]。

芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，且可形成抗逆性的芽孢，便于運輸和儲藏，是一種理想的生防微生物[6-7]。目前應(yīng)用的農(nóng)業(yè)生防制劑多采用芽孢桿菌作為菌種資源，制劑中芽孢的含量是影響制劑應(yīng)用效果的關(guān)鍵因素[8-9]，因此在芽孢桿菌菌株進行工業(yè)化生產(chǎn)前，須要通過發(fā)酵工藝優(yōu)化提高發(fā)酵液中芽孢的產(chǎn)量。從不同生境中篩選分離的芽孢桿菌菌株對營養(yǎng)及生長條件要求不同，優(yōu)化適合特定生境菌株的發(fā)酵條件是菌劑工業(yè)化生產(chǎn)的基礎(chǔ)。不同學(xué)者利用單因素、正交設(shè)計和響應(yīng)面分析方法優(yōu)化芽孢桿菌的發(fā)酵工藝，提高芽孢產(chǎn)量。侯敏等采用單因素和正交試驗對芽孢桿菌S13產(chǎn)芽孢培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，芽孢數(shù)量達到4.9×109 CFU/mL，芽孢產(chǎn)率達到90%[10];盧彩鴿等利用響應(yīng)面分析方法對芽孢桿菌MH71的產(chǎn)芽孢培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，優(yōu)化后芽孢數(shù)量達到1.2×109 CFU/mL[11]。發(fā)酵條件優(yōu)化不僅能夠提高芽孢產(chǎn)率，而且能降低生產(chǎn)能耗，提高經(jīng)濟效益。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S12是從新疆綠洲棉田中分離獲得的1株廣譜抗真菌生防菌株，尤其對大麗輪枝菌具有較強的拮抗作用[12]，具備微生物菌劑商業(yè)化開發(fā)的潛力。芽孢含量是影響微生物殺菌劑貯藏運輸和防治效果的關(guān)鍵因素[13-14]。本研究團隊前期采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化確定了菌株S12產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基的優(yōu)化配比組合[15]，為了進一步提高發(fā)酵液中菌株S12的芽孢產(chǎn)量，本試驗在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上采用單因素和正交設(shè)計試驗對芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 生防芽孢桿菌S12分離自新疆連作棉田根際土壤，4 ℃試管斜面保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂粉15 g/L，pH值7.0～7.2;NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，牛肉浸膏3 g/L，NaCl 5 g/L，pH值7.0-7.2;發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉13 g/L，大豆蛋白胨15.1 g/L，CaCO3 0.7 g/L，NaH2PO4·2H2O 2 g/L，Na2HPO4·2H2O 4 g/L，pH值7.0～7.2[14]。

1.2 種子液的制備

1.2.1 菌株活化及培養(yǎng) 將保存的菌株S12接種于NA培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)16 h。

1.2.2 種子發(fā)酵 將活化的菌株S12接種到裝有40 mL NB培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，于搖床30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)14 h作為種子液。

1.3 單因素試驗

將培養(yǎng)14 h的種子液接入配制的發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為1%，250 mL的三角瓶裝液量為60 mL，pH值7.0，150 r/min、30 ℃振蕩培養(yǎng)84 h進行發(fā)酵，為了進行單因素試驗篩選，依次對以上發(fā)酵條件中的發(fā)酵時間、初始pH值、溫度、轉(zhuǎn)速接種量、裝液量進行改變，其中分別設(shè)定發(fā)酵時間為36、48、60、72、84、96 h，初始pH值為5、6、7、8、9、10，溫度為20、25、30、35、40 ℃;轉(zhuǎn)速為120、140、160、180、200 r/min，接種量為1%、3%、5%、7%、9%，250 mL三角瓶裝液量為40、60、80、100、120 mL，考察各因素對芽孢數(shù)量、菌體數(shù)量和芽孢產(chǎn)率的影響，從而確定正交試驗的因素及水平。

1.4 正交設(shè)計試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定對菌株S12芽孢產(chǎn)量影響因素的考察水平，按照正交試驗表L18（36）設(shè)計6因素3水平的正交試驗，比較裝液量、溫度、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵時間、接種量不同水平組合對S12菌株芽孢數(shù)量、菌體數(shù)量和芽孢產(chǎn)率的影響。

1.5 測定項目及方法

采用系列稀釋平板涂布法進行菌體和芽孢計數(shù)，其中芽孢計數(shù)前將發(fā)酵菌液經(jīng)過80 ℃水浴15 min后進行。芽孢產(chǎn)率=芽孢數(shù)量/菌體數(shù)量×100%。試驗于2018年在新疆農(nóng)墾科學(xué)院作物種質(zhì)創(chuàng)新與基因資源利用兵團重點實驗室進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理分析

采用Excel2007軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，運用GraphPad Prism 5.0軟件作圖，采用SPSS 17.0軟件進行正交試驗設(shè)計和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件單因素試驗

2.1.1 發(fā)酵時間

隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)逐漸增多的趨勢（圖1-A），分別由36 h的0.028×109、0.155×109 CFU/mL增加到96 h的2.230×109、2.330×109 CFU/mL;當(dāng)發(fā)酵時間延長到84 h時，芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均達到最大值，分別為2.240×109、2.350×109 CFU/mL;此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值95.32%，因此選擇72、84、96 h作為正交試驗的發(fā)酵時間的3個水平。

2.1.2 初始pH值

隨著發(fā)酵液初始pH值的升高，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖1-B），pH值為7時均達到最大值，分別為2.212×109、2.292×109 CFU/mL，此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值96.42%。從圖1-B可以看出，發(fā)酵濾液呈酸性或堿性，對芽孢的形成和菌體生長均影響較大，因此選擇pH值為7作為正交試驗發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值。

2.1.3 溫度

隨著發(fā)酵溫度的升高，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖1-C），發(fā)酵溫度為35 ℃時均達到最大值，分別為3.675×109、3.766×109 CFU/mL，此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值97.60%。當(dāng)溫度低于或高于35 ℃時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均有所下降，因此，選擇30、35、40 ℃作為正交試驗的發(fā)酵溫度的3個水平。

2.1.4 轉(zhuǎn)速

隨著轉(zhuǎn)速的增加，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖1-D），轉(zhuǎn)速為180 r/min時均達到最大值，分別為3.590×109、3.930×109 CFU/mL，此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值91.38%。當(dāng)轉(zhuǎn)速高于或是低于180? r/min 時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均有所下降，因此選擇160、180、200? r/min作為正交試驗的轉(zhuǎn)速的3個水平。

2.1.5 接種量

隨著接種量的增加，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖1-E），但趨勢變化不大，接種量為5%時均達到最大值，分別為3.255×109、3.375×109 CFU/mL，此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值96.46%。當(dāng)接種量高于或是低于5%時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均有所下降，因此選擇3%、5%、7%作為正交試驗的轉(zhuǎn)速的3個水平。

2.1.6 裝液量

隨著裝液量的增加，發(fā)酵液中芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢（圖1-F），裝液量為80 mL/250 mL時均達到最大值，分別為3.675×109 CFU/mL、3.766×109 CFU/mL，此時芽孢產(chǎn)率也達到最大值97.53%。當(dāng)接種量高于或是低于80 mL/250 mL時，發(fā)酵液中的芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量均有所下降，因此選擇60、80、100 mL/250 mL 作為正交試驗的轉(zhuǎn)速的3個水平。

2.2 發(fā)酵條件正交試驗優(yōu)化

單因素的試驗結(jié)果表明，發(fā)酵條件不同因素對菌株S12芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量都有影響，為綜合評價各發(fā)酵因子對S12菌株芽孢數(shù)量和菌體數(shù)量，采用L18（36）正交表，設(shè)計6因素3水平正交試驗，以進一步確定影響S12菌株發(fā)酵產(chǎn)芽孢各發(fā)酵因子的最佳組合。

從表1可以看出，產(chǎn)芽孢發(fā)酵各條件最佳組合為A2B2C2E3F3，即產(chǎn)芽孢最佳發(fā)酵條件為裝液量80 mL/250 mL、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、時間96 h、接種量7%，5個因素的主次順序依次為A（裝液量）>B（溫度）>E（時間）>C（轉(zhuǎn)速）>F（接種量）。產(chǎn)菌體各發(fā)酵條件最佳組合為A2B2C2E3F3，即產(chǎn)芽孢最佳發(fā)酵條件為裝液量80 mL/250 mL、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、時間96 h、接種量7%，5個因素的主次順序依次為A（裝液量）>E（時間）>B（溫度）>C（轉(zhuǎn)速）≈F（接種量）。芽孢產(chǎn)率各發(fā)酵條件最佳組合為A2B2C2E2F3，即產(chǎn)芽孢最佳發(fā)酵條件為裝液量80 mL/250 mL、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min、時間84 h、接種量7%，5個因素的主次順序依次為A（裝液量）>B（溫度）>E（時間）>C（轉(zhuǎn)速）>F（接種量）。極差評價分析結(jié)果顯示，裝液量是影響發(fā)酵條件的主要因素，其次是溫度和時間，最后是轉(zhuǎn)速和接種量。

發(fā)酵條件優(yōu)化的方差評價結(jié)果見表2、表3、表4。其中，產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件中，因素A和B的P值均小于0.05，即這2種因素對產(chǎn)芽孢數(shù)量試驗結(jié)果影響顯著;因素C、E和F的P值均大于0.10，即因素C、E和F對試驗結(jié)果影響不顯著;各因素主次順序為A（裝液量）>B（溫度）>C（轉(zhuǎn)速）>E（時間）>F（接種量）（表2）。產(chǎn)菌體發(fā)酵條件中，因素A的P值小于0.05，即該因素對產(chǎn)菌體數(shù)量試驗結(jié)果影響顯著;因素B和E的P值均小于0.10，即因素B、E對試驗結(jié)果有一定的影響;而C和F的P值均大于0.10，即因素C和F對試驗結(jié)果影響不顯著;各因素的主次順序為A（裝液量）>E（時間）>B（溫度）>C（轉(zhuǎn)速）>F（接種量）（表3）。芽孢產(chǎn)率發(fā)酵條件中，因素A的P值小于0.05，即該因素對產(chǎn)菌體數(shù)量試驗結(jié)果影響顯著;因素B的P值小于0.10，即因素B對試驗結(jié)果有一定影響;而C、E和F的P值均大于0.10，即因素C、E和F對試驗結(jié)果影響不顯著;各因素影響試驗結(jié)果的主次順序為A（裝液量）>B（溫度）>E（時間）>C（轉(zhuǎn)速）>F（接種量）（表4）。方差評價結(jié)果顯示，裝液量是對試驗結(jié)果顯著影響的因素，溫度和時間是有一定影響的因素，而轉(zhuǎn)速和接種量是影響不顯著的因素，與極差評價結(jié)果基本一致。

根據(jù)方差分析法的結(jié)果，只須對試驗結(jié)果有顯著影響的因素選取最佳水平，而影響較小的因素則可按實際需要和投入產(chǎn)出效益選擇適當(dāng)?shù)乃絒16]。本試驗發(fā)酵條件各因素的較佳組合為A2B2C1E2F1，即菌株S12產(chǎn)芽孢搖瓶培養(yǎng)較佳發(fā)酵條件為裝液量80 mL/250 mL、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、時間84 h、接種量3%。

2.3 驗證試驗

發(fā)酵條件優(yōu)化后的組合為：裝液量80 mL/250 mL、接種量3%、初始pH值7.0、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、時間84 h，此條件下芽孢產(chǎn)量為5.721×109 CFU/mL，活菌數(shù)為5.822×109 CFU/mL，比優(yōu)化前（芽孢為2.240×109 CFU/mL，菌體為2.350×109 CFU/mL）分別增加2.55、2.48倍，此時發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)率為98.28%。

3 討論與結(jié)論

隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展、居民生活水平的不斷提高，消費者對農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量安全要求也越來越高。綠色有機生態(tài)農(nóng)業(yè)備受人們重視。在生態(tài)農(nóng)業(yè)病蟲害防治方面，環(huán)保無毒害作用的生防菌劑逐漸發(fā)揮作用并且替代了部分化學(xué)農(nóng)藥，其生產(chǎn)量和需求量日益增高[17-18]。作為生防菌劑菌種資源的芽孢桿菌，由于具有來源廣泛、繁殖力強、對人畜無害、不污染環(huán)境等特點，成為近年來研究和應(yīng)用的熱點[6]。芽孢桿菌不僅能產(chǎn)生多種脂肽類抑菌物質(zhì)，抑制真菌病原菌的生長，還具有誘導(dǎo)作物產(chǎn)生抗病性的作用，并且可形成抗逆性的芽孢，便于運輸和儲藏，是一種理想的商業(yè)化生防微生物。

正交試驗設(shè)計是研究多因素、多水平一種設(shè)計方法，具有高效、快速、經(jīng)濟的優(yōu)勢[16]。蔣盼盼等采用正交試驗設(shè)計對解淀粉芽孢桿菌B1619發(fā)酵工藝進行了優(yōu)化，優(yōu)化后發(fā)酵菌液含菌量同初始發(fā)酵工藝相比提高87.83%[16]。成莉鳳等采用正交試驗設(shè)計研究枯草芽孢桿菌BE-91生長及其胞外表達β-甘露聚糖酶的發(fā)酵條件的優(yōu)化組合，優(yōu)化條件下發(fā)酵10 h，β-甘露聚糖酶活性最高達432.4 IU/mL，即縮短了發(fā)酵時間也提高了酶活性[19]。發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化是微生物發(fā)酵產(chǎn)品成功實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的重要環(huán)節(jié)?？莶菅挎邨U菌S12產(chǎn)芽孢發(fā)酵工藝涉及的因素較多，無法逐一地進行研究，因此根據(jù)細菌發(fā)酵工藝參數(shù)，首先進行單因素試驗篩選，然后再根據(jù)篩選結(jié)果設(shè)計正交試驗對枯草芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化，以期獲得菌株S12產(chǎn)芽孢的最佳發(fā)酵條件參數(shù)，提高其發(fā)酵液中的芽孢含量，降低投入成本，為微生物菌劑的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

試驗結(jié)果表明，單因素試驗篩選和正交試驗設(shè)計結(jié)合是一種較好的設(shè)計組合，能在較短的時間內(nèi)確定發(fā)酵工藝的關(guān)鍵參數(shù)[16]。驗證試驗結(jié)果表明，優(yōu)化后獲得的枯草芽孢桿菌S12產(chǎn)芽孢的發(fā)酵條件為：裝液量80 mL/250 mL、接種量3%、初始pH值7.0、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速160 r/min、時間84 h。該研究結(jié)果不僅提高了發(fā)酵液中芽孢的數(shù)量和產(chǎn)率，并為枯草芽孢桿菌S12進一步產(chǎn)業(yè)化的開發(fā)節(jié)約了生產(chǎn)成本。但本試驗對枯草芽孢桿菌S12發(fā)酵條件優(yōu)化僅進行了搖瓶發(fā)酵的初步研究，以上參數(shù)有待于在后續(xù)工廠化生產(chǎn)中進一步驗證，從而為該菌株用于生防菌劑的研制提供理論依據(jù)

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