董飛　王淑芳　張笑　徐劍宏　史建榮

摘要：為進(jìn)一步優(yōu)化和完善小麥中主要鐮刀菌毒素的固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)法，探索了粒徑和取樣量對(duì)脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和玉米赤霉烯酮檢測(cè)的影響。結(jié)果表明，當(dāng)粉碎粒徑為20目時(shí)，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量為1 868±115 μg/kg，除10目外，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品;3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇含量分別為9±2 μg/kg和13±2 μg/kg，除40目外，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品;玉米赤霉烯酮含量為590±15 μg/kg，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品。在樣品充分混勻條件下，取樣量對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有顯著影響，但隨著取樣量的增加，精密度會(huì)得到提高。因此，采用本研究方法檢測(cè)小麥中主要鐮刀菌毒素時(shí)，樣品應(yīng)完全粉碎過20目篩;同時(shí)，可適當(dāng)增加取樣量，以提高檢測(cè)結(jié)果的精密度。

關(guān)鍵詞：小麥;固相萃取;高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;粒徑;取樣量;鐮刀菌毒素;檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S435.121.4+5?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）19-0206-04

收稿日期：2019-12-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31772118、31701748）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（17）1003]。

作者簡介：董 飛（1985—），男，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。Tel：（025）84392003;E-mail：feidong1985@126.com。

通信作者：史建榮，博士，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。Tel：（025）84392001;E-mail：jianrong63@126.com。

小麥赤霉病是由禾谷鐮刀菌復(fù)合群引起的一種世界性真菌病害，不僅影響小麥產(chǎn)量，還會(huì)導(dǎo)致小麥中鐮刀菌毒素嚴(yán)重污染，對(duì)人畜健康造成危害[1-2]。脫氧雪腐鐮刀菌烯（DON）及其乙?；苌颷3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3ADON），15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15ADON）]和玉米赤霉烯酮（ZEN）是我國小麥中最為常見的鐮刀菌毒素[1，3-5]。

目前，國內(nèi)外報(bào)道最多的檢測(cè)真菌毒素的前處理方法主要有免疫親和柱法[6-8]、多功能凈化柱法[3，9]和固相萃取法[10-12]，其中前兩者價(jià)格昂貴，相比較而言，固相萃取法是一種可同時(shí)檢測(cè)小麥中多種鐮刀菌毒素的廉價(jià)高效的前處理方法。但長期以來，在采用該方法作為前處理方法時(shí)，國內(nèi)外研究學(xué)者比較重視樣品的提取凈化和儀器分析工作，而對(duì)樣品制備的研究嚴(yán)重缺乏。研究表明，樣品制備過程尤其是樣品的粉碎粒徑對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有直接影響[13-14]。此外，樣品粉碎后，分析樣品的取樣量對(duì)分析誤差也會(huì)產(chǎn)生影響[13]。本研究在前人的檢測(cè)方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確粒徑和取樣量對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果的影響，對(duì)優(yōu)化和完善小麥中主要鐮刀菌毒素的固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

主要儀器有：高效液相色譜儀20ADXR，日本島津公司;質(zhì)譜儀AB6500，美國AB公司;旋風(fēng)粉碎磨，杭州錢江儀器設(shè)備有限公司;固相萃取儀Visiprep 24TM DL，美國Supelco公司;離心機(jī)5810R，德國Eppendorf公司;氮吹儀N-WVAPTM 112，美國Organomation公司;電子天平Y(jié)P3002，上海佑科儀器儀表有限公司;電子天平BT125D，德國Satorius公司;氨基固相萃取柱，500 mg，6 mL，上海安譜科學(xué)儀器有限公司;0.22 μm有機(jī)濾膜，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

主要試劑有：DON、3ADON、15ADON、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥99%，Romer國際貿(mào)易（北京）有限公司;乙腈和甲醇，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲醇，色譜純，德國Merck公司;乙酸銨，色譜純，美國Tedia公司;試驗(yàn)用水為Milli-Q超純水，美國Millipore公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱為WatersAtlantis T-3色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）。流動(dòng)相：A為水（含5 mmol/L 乙酸銨），B為甲醇。采用線性梯度洗脫，0～2 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由75%下降到30%;2～4 min，流動(dòng)相水相（A）比例由30%下降到10%;4～6 min，保持流動(dòng)相中水相（A）比例為10%;6～9 min，流動(dòng)相中水相（A）比例由10%上升至75%;10～15 min，保持流動(dòng)相中水相（A）比例為75%。流速為0.7 mL/min，單次運(yùn)行時(shí)間總共為15 min。

1.3 質(zhì)譜條件

離子化模式為電噴霧電離正離子模式（ESI+），檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），離子源溫度為500 ℃，駐留時(shí)間100 ms，霧化氣壓34.5 kPa，輔助氣壓34.5 kPa，噴霧電壓5 500 V，碰撞室射出電壓6 V。4種鐮刀菌毒素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 樣品提取凈化

樣品的提取凈化采用優(yōu)化Njumbe的方法[10]，將小麥粉碎至完全通過20目篩，準(zhǔn)確稱取均質(zhì)樣品5.0 g，加入4倍樣品質(zhì)量體積（20 mL）的乙腈-水（V ∶V，80 ∶20），在180 r/min搖床上振蕩30 min，3 200 r/min 離心15 min后取上清，轉(zhuǎn)移到新的容器中，待凈化。將氨基固相萃取柱連接在固相萃取儀上，分別用5 mL甲醇和甲醇-水（V ∶V，80 ∶20）活化。準(zhǔn)確移取5 mL 待凈化的上清液加入固相萃取柱中，以約1 s/滴的流速通過固相萃取柱，收集過柱液，向固相萃取柱中加入10 mL 甲醇-水（V ∶V，80 ∶20）洗脫，收集全部洗脫液，合并過柱液和洗脫液于干凈的玻璃試管中，用氮?dú)獯蹈?，向殘留物中加? mL流動(dòng)相溶液，于渦旋混合器上振蕩1 min，過0.22 μm有機(jī)濾膜，供高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）檢測(cè)。

1.5 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照SN/T 3136—2012和GB 5009.111—2016中的方法[15-16]對(duì)從市場(chǎng)購買的小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，取未檢出DON、3ADON、15ADON、ZEN的空白小麥樣品，粉碎至完全通過20目篩。準(zhǔn)確稱取5.0 g空白樣品，加入50 mL具塞三角瓶中，采用“1.4”節(jié)的方法提取凈化，將DON、3ADON、15ADON、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用上述空白基質(zhì)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.6 本研究方法的回收率測(cè)定

采用本研究建立的方法對(duì)添加4種鐮刀菌毒素的小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，并測(cè)定回收率。分別在空白小麥樣品中添加4種鐮刀菌毒素，使DON濃度分別為10、20、100 μg/kg;3ADON和15ADON濃度分別為5、10、50 μg/kg;ZEN濃度分別為3、6、30 μg/kg。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

用Microsoft Excel 16.0軟件處理數(shù)據(jù)，用SPSS（IBM）19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)算回收試驗(yàn)中4種鐮刀菌毒素的回收率平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）;計(jì)算不同粉碎粒徑和取樣量條件下4種鐮刀菌毒素含量的平均值、RSD及差異顯著性等。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)方法的線性范圍與靈敏度

取空白小麥樣品進(jìn)行提取凈化，將DON、3ADON、15ADON、ZEN標(biāo)準(zhǔn)品用空白基質(zhì)稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中，DON系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為10、30、120、600、1 200 μg/kg;3ADON和15ADON系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為5、10、50、100、200 μg/kg;ZEN系列標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為3、6、12、30、60、120 μg/kg。以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）作線性回歸方程，根據(jù)3倍信噪比的峰響應(yīng)值得到本研究方法的檢出限，根據(jù)10倍信噪比的峰響應(yīng)值得到線性范圍的下限。結(jié)果顯示，DON、3ADON、15ADON、ZEN線性范圍分別為10～1200、5～200、5～200、3～120 μg/kg;基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.999 9、0.999 7、0.999 8、0.999 9;檢出限（LOD）分別為5、2、2、1 μg/kg;定量限（LOQ）分別為10、5、5、3 μg/kg。

2.2 試驗(yàn)方法的回收率

采用本研究方法對(duì)添加4種鐮刀菌毒素的小麥樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表2）表明，DON的加標(biāo)回收率為87.5%～94.2%，RSD為5.4%～7.2%;3ADON的加標(biāo)回收率為86.9%～93.2%，RSD為5.3%～6.8%;15ADON的加標(biāo)回收率為88.4%～95.2%，RSD為4.8%～7.5%;ZEN的加標(biāo)回收率為88.5%～96.6%，RSD為4.5%～5.8%。

2.3 粒徑對(duì)鐮刀菌毒素檢測(cè)結(jié)果的影響

按照SN/T 3136—2012和GB 5009.111—2016中的方法[15-16]對(duì)2016年江蘇省新收獲小麥進(jìn)行檢測(cè)，篩選得到DON、3ADON、15ADON、ZEN含量分別為1 950、12、14、610 μg/kg的小麥樣品。將篩選得到的小麥樣品充分混勻，采用四分法混合縮分，分別粉碎至完全通過10、20、40、60目篩后待用，以未粉碎的小麥樣品為對(duì)照，待檢測(cè)小麥樣品于4 ℃保存。

采用“1.4”節(jié)中的方法對(duì)不同粒徑和未粉碎小麥樣品進(jìn)行提取凈化及HPLC-MS/MS檢測(cè)，試驗(yàn)設(shè)5次重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。當(dāng)粉碎粒徑為20目時(shí)，DON含量為1 868±115 μg/kg，除與10目沒有顯著差異外，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品;3ADON、15ADON含量分別為（9±2）、（13±2） μg/kg，除與40目沒有顯著差異外，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品;ZEN含量為（590±15） μg/kg，顯著高于其他粒徑和未粉碎樣品。總體而言，在檢測(cè)小麥中DON、3ADON、15ADON、ZEN的含量時(shí)，應(yīng)將小麥粉碎至完全通過20目篩。

2.4 取樣量對(duì)鐮刀菌毒素檢測(cè)結(jié)果的影響

取“2.3”節(jié)中完全粉碎通過20目篩的小麥樣品，充分混合均勻，采用“1.4”節(jié)中的方法對(duì)不同取樣量小麥樣品進(jìn)行提取凈化及HPLC-MS/MS檢測(cè)，試驗(yàn)設(shè)5次重復(fù)，比較取樣量大小對(duì)4種鐮刀菌毒素檢測(cè)結(jié)果的影響，結(jié)果如表4所示。DON、3ADON、15ADON、ZEN含量在不同取樣量間沒有顯著差異;但是隨著取樣量的增加，樣品重復(fù)之間的RSD呈下降趨勢(shì)，精密度會(huì)得到提高，這一結(jié)果與前人研究結(jié)果[13]相一致。因此，在樣品充分混勻的情況下，可適當(dāng)增加樣品的取樣量。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，采用固相萃取-高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)小麥中DON、3ADON、15ADON、ZEN含量時(shí)，樣品粉碎粒徑對(duì)4種鐮刀菌毒素的定量檢測(cè)有顯著影響，應(yīng)將小麥粉碎至完全通過20目篩。取樣量對(duì)4種鐮刀菌毒素的檢測(cè)結(jié)果沒有顯著影響，但是對(duì)精密度會(huì)有影響;在條件允許的情況下，可適當(dāng)提高取樣量。目前，國際上對(duì)真菌毒素分析過程中的樣品制備高度重視[17]，并呼吁制定統(tǒng)一的樣品制備標(biāo)準(zhǔn)程序。但國內(nèi)長期以來比較重視樣品提取凈化和儀器分析工作，對(duì)樣品制備的研究比較缺乏，部分檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品粉碎粒徑或取樣量規(guī)定不夠明確[15-16，18]。因此，在制訂檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，應(yīng)明確樣品制備要求，引入具備一定功能的樣品粉碎設(shè)備，進(jìn)而逐步提高我國主糧產(chǎn)品中真菌毒素檢測(cè)能力。

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