胡麗松 吳思婷 段興帥 岑怡 蘇岳峰 范睿 伍寶朵 郝朝運

摘? 要：為系統(tǒng)篩選適合胡椒基因表達模式分析的內參基因，本研究基于胡椒全基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，初步篩選出62個候選基因。以胡椒主根、芽尖、葉片、花穗、不同發(fā)育時期果實以及接種辣椒疫霉菌的主蔓為材料，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件系統(tǒng)分析候選基因在不同組織中的表達穩(wěn)定性，結合目標基因的表達模式驗證，鑒定穩(wěn)定表達最優(yōu)的內參基因為Myeloid leukemia factor 1 （Pn17.1212）。結果表明：該基因是分析胡椒果實發(fā)育、辣椒疫霉菌響應相關基因表達模式的理想內參。內參基因的選擇不應僅限于持家基因，全基因組和轉錄組信息可提供更加全面的參考基因數(shù)據(jù)，內參基因的準確鑒定需綜合轉錄組信息、基因表達穩(wěn)定性、標記基因的表達模式驗證等數(shù)據(jù)分析的結果，獲得的理想內參基因可滿足不同研究對表達穩(wěn)定性的要求。

關鍵詞：胡椒;內參基因;表達穩(wěn)定性

中圖分類號：S813.3? ? ? 文獻標識碼：A

Abstract： In order to identify the internal control gene for the gene expression analysis in black pepper， 62 candidate internal control genes were selected by a preliminary assessment of genome and transcriptome data. The stability of gene expression was investigated using geNorm， NormFinder and BestKeeper in a diverse set of 16 samples， including root， shoot apices， leaf， flower， fruits at different developmental stages and the stems at different time after inoculated with Phytophthora capsici. By combining with the expression pattern of target gene， the gene Myeloid leukemia factor 1 （Pn17.1212） with ideal stable expression was identified. It can be considered as an ideal internal control gene in the analysis gene expression pattern of fruit development and Phytophthora capsica infection. The selection of internal reference genes should not be limited to housekeeping genes， the genome and transcriptome data could provide more candidate genes. The identification of internal reference genes should require a comprehensive analysis such as transcriptome， expression stability and expression pattern validation of marker genes. An ideal internal control gene could be applied in different researches with different requirement of the stability of expression.

Keywords： black pepper; internal control gene; the stability of expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.10.018

胡椒（Piper nigrum L.）為胡椒科（Piperaceae）胡椒屬（Piper）熱帶木質藤本作物，素有“香料之王”的美譽，是世界上重要的香辛料作物之一 。胡椒廣泛種植于熱帶、亞熱帶30多個國家和地區(qū)，是服務國家“一帶一路”倡議的重要媒介作物。我國胡椒種植面積與年產(chǎn)量均居世界第5位，已發(fā)展成為年產(chǎn)值超20億，關系到100萬以上農村人口就業(yè)的重要熱作產(chǎn)業(yè)，是助力當?shù)鼐珳史鲐毜奶厣魑锂a(chǎn)業(yè)[1]。胡椒是首批入選“藥食同源”的香料作物之一，在中醫(yī)藥研究和人民健康飲食領域有著不俗潛力[2]。我國胡椒主栽品種為‘熱引1號，占總種植面積的90%以上，由辣椒疫霉菌引起的胡椒瘟病是限制胡椒產(chǎn)業(yè)發(fā)展的最重要的病害。另外，胡椒優(yōu)勢種植區(qū)之間環(huán)境差異較大，各產(chǎn)區(qū)胡椒品質良莠不齊，影響我國胡椒的市場競爭力。高抗胡椒瘟病和高胡椒堿的優(yōu)異新品種選育是亟需解決的產(chǎn)業(yè)問題。由于世界胡椒產(chǎn)業(yè)主要分布在熱帶地區(qū)的發(fā)展中國家，該地區(qū)科研水平相對落后，分子育種技術的研發(fā)仍缺乏可應用的基因資源。

基因表達模式分析是分子生物學常用的實驗技術，廣泛應用于功能基因組學研究中，理想的內參基因是目標基因表達模式分析的最基礎的數(shù)據(jù)之一[3-4]。在研究不同性狀相關基因的表達特性時，穩(wěn)定內參基因的篩選和鑒定不可或缺[5-7]。中國熱帶農業(yè)科學院香料飲料研究所胡麗松等[8]以胡椒栽培種‘熱引1號的主根、主蔓、花序和不同發(fā)育時期果實為材料，分析了9個持家基因的表達穩(wěn)定性，篩選出適合做胡椒果實發(fā)育的內參基因Histion 3-1和Polyubiquitin 1。印度香料研究所Palaniyandi等[9]參考胡椒葉片轉錄組基因數(shù)據(jù)，以辣椒疫霉菌處理后不同發(fā)育時期的葉片為材料，篩選出適用于辣椒疫霉菌抗性相關基因表達分析的內參PnGAPDH。盡管上述研究已經(jīng)篩選出表達量相對穩(wěn)定的內參基因，與模式作物相比，仍有一定的缺陷。首先，由于胡椒全基因組信息的缺失，內參基因的參考序列數(shù)據(jù)不夠全面。其次，候選基因的選擇根據(jù)持家基因的功能注釋查找同源序列，基因的選擇受到限制，相應的內參基因的評估并不理想。另外，研究者根據(jù)各自的需求，分別單獨對胡椒抗瘟病和果實發(fā)育2個重要的生物學過程展開研究，篩選的內參基因在不同的組織之間并不通用。因此，適合胡椒分子生物學研究需要的內參基因仍有待進一步系統(tǒng)研究。

胡椒全基因組測序工作的完成和不同組織轉錄組信息的完善，為內參基因的鑒定提供了豐富的數(shù)據(jù)來源[10-12]。為系統(tǒng)鑒定胡椒理想的內參基因，本研究在胡椒全基因組和轉錄組測序的基礎上，根據(jù)轉錄組數(shù)據(jù)庫基因表達變異系數(shù)（CV）的大小篩選內參基因候選序列，基于實時熒光定量PCR技術，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件進行表達穩(wěn)定性分析，結合基因表達模式驗證，系統(tǒng)鑒定出穩(wěn)定的基因。研究結果為胡椒差異表達基因的篩選提供了內參基因，也為其他非模式作物的內參基因鑒定提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

以我國胡椒主栽品種‘熱引1號（P. nigrum cv. Reyin-1）為材料，樹齡15 a，種植于農業(yè)農村部萬寧胡椒種質資源圃。收集胡椒主根、芽尖、葉片、花序、不同發(fā)育時期果實（開花后2個月、4個月、6個月、8個月），以及經(jīng)胡椒瘟病病菌接種的主蔓（菌感染0、4、8、12、24、48、72 h）和空白對照的主蔓混合樣（無菌水接種0、4、8、12、24、48、72 h）共16個組織，其中，根據(jù)辣椒疫霉菌的發(fā)病特征，主蔓接種位置選擇為地上20 cm處，每個組織從不同的植株上取樣3次，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? 方法

1.2.1? RNA提取和cDNA合成? 所有樣品在液氮下研磨成粉末，總RNA提取按照Trizol試劑說明書進行。提取RNA后用Nanodrop 2000C測定RNA的濃度和純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性及純度。取1 μg總RNA，按照全式金TransGen反轉錄試劑盒說明書合成cDNA模版，以1∶10稀釋后于?20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 引物設計和擴增? 根據(jù)項目組前期公布的胡椒全基因組信息和轉錄組數(shù)據(jù)，選取表達變異系數(shù)小于8以及已經(jīng)報道的1個內參基因Polyubiquitin 1，共63個候選基因。根據(jù)基因序列設計引物。候選基因擴增程序為：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性10 s，58 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，在延伸階段采集熒光信息，擴增40個循環(huán)。擴增完成后，進行熔解曲線分析，溫度從60 ℃緩慢遞增至95 ℃，連續(xù)測定樣品的熒光強度，根據(jù)溶解曲線熒光變化確定擴增產(chǎn)物的特異性。

實時熒光定量PCR分析按照SYBR PremixExTaqTM II試劑說明書進行，擴增測序為兩步法：95 ℃預變性3 min;95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s并收集熒光信號，擴增40個循環(huán)，根據(jù)Ct值（cycle threshold mean）計算基因表達豐度[13]。

1.2.3? 候選內參基因的表達穩(wěn)定性分析? 讀取每個反應的Ct值，利用內參基因分析軟件geNorm、NormFinder和BestKeeper分析候選內參基因的表達穩(wěn)定性。其中，軟件geNorm、NormFinder以基因的2?ΔΔCt為輸入數(shù)據(jù)，具體方法為：首先找到候選基因在所有樣品中的最小Ct值，用其他樣品的Ct值減去最小Ct值，得到ΔΔCt，利用excel函數(shù)

計算2?ΔΔCt值，獲得分析所需原始數(shù)據(jù)。軟件geNorm通過內參基因標準化的配對差異分析值（Vn/Vn+1）來確認內參基因的合適數(shù)量，默認V值為0.15，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內參基因的數(shù)量為n個，若Vn/Vn+1>0.15，則最適內參基因的數(shù)量為n+1個。Bestkeeper直接以Ct值為分析數(shù)據(jù)，計算候選基因表達標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）值，選擇SD和CV值最小的基因為內參基因。

2? 結果與分析

2.1? 候選內參基因的引物設計與特異性鑒定

根據(jù)62個候選基因序列設計擴增引物，引物退火溫度為58 ℃，PCR產(chǎn)物長度為100～200 bp，同時選取已報道的胡椒內參基因Polyubiquitin 1作為對照，引物信息見表1。以16個組織的cDNA為混合模板，采用實時熒光定量PCR技術分析基因的擴增及溶解曲線。結果顯示，候選基因的擴增曲線呈指數(shù)分布，溶解曲線信號峰特異，表明引物擴增產(chǎn)物特異，無非特異擴增帶，可用于后續(xù)表達穩(wěn)定性分析（圖1）。

2.2? 候選內參基因的表達穩(wěn)定性分析

2.2.1? 候選內參基因的表達穩(wěn)定性geNorm分析? geNorm軟件通過對內參基因在不同胡椒組織中的平均表達穩(wěn)定指數(shù)（the gene stability measure value，M值）的排序來確定最穩(wěn)定表達的基因，M值越小，內參基因的穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差。結果表明，以M<0.5為閾值時，共有40個候選基因符合要求（圖2）。由內參基因標準化的配對差異分析值（Vn/Vn+1）發(fā)現(xiàn)，候選內參基因的標準化配對差異值（Vn/Vn+1）均小于0.15，說明候選內參基因的整體表達穩(wěn)定性較好，符合條件的候選基因中只需要選擇2個作為內參基因即可滿足不同組織中基因表達分析的要求（圖3）。為進一步明確最優(yōu)的內參基因，本研究同時采用NormFinder和BestKeeper軟件分析候選基因的表達穩(wěn)定性。

2.2.2? 候選內參基因的表達穩(wěn)定性NormFinder分析? NormFinder軟件通過計算不同樣品組間的方差評估候選內參基因的表達穩(wěn)定值，穩(wěn)定值越低，基因表達越穩(wěn)定。由圖4可知，候選基因表達穩(wěn)定性最好的5個序列編號分別是Pn3.3865、Pn1.1328、Pn17.1212、Pn5.3111、Pn6.1073。

2.2.3? 候選內參基因表達穩(wěn)定性BestKeeper分析? BestKeeper軟件通過比較SD和CV值的大小，分析各基因的穩(wěn)定性，SD越小，CV值越小，基因穩(wěn)定性就越好。候選內參基因在胡椒全組織、胡椒果實發(fā)育以及胡椒瘟病病菌誘導組織中的表達穩(wěn)定性BestKeeper分析結果如表2所示，表達穩(wěn)定性最好的5個供測序列編號分別為：Pn14.1802、Pn15.1270、Pn13.1022、Pn17.1212、Pn3.100。

2.3? 候選內參基因的鑒定與驗證

綜合轉錄譜數(shù)據(jù)中候選基因的CV值和不同軟件的分析結果發(fā)現(xiàn)，基因Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）在轉錄組數(shù)據(jù)中的CV值最低，并且在NormFinder和BestKeeper分析結果中，該基因的表達穩(wěn)定性評估均排在前5名以內。為進一步驗證該基因在實際表達模式分析中的效果，我們分別以Pn17.1212和Pn3.100、Pn17.1212、Pn5.311三個候選基因組合為內參，分析5個具有不同表達模式基因在不同組織中的表達情況。結果表明，單獨以Pn17.1212和以3個基因組合作為內參，均可一致地反應出不同基因的表達差異，且兩組結果之間基因表達模式相對一致（圖5）。因此，我們認為基因Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）是本研究中最優(yōu)的內參基因，可滿足胡椒不同組織間特異表達基因、果實發(fā)育相關基因和辣椒疫霉菌侵染響應相關基因的表達模式分析。

3? 討論

內參基因在cDNA模板均一化、基因表達模式分析中起重要作用。持家基因（Housekeeping gene）組成型、穩(wěn)定表達的特征使其成為天然的內參基因最佳候選[14-15]。在擬南芥、水稻、棉花等模式植物和重要經(jīng)濟作物中，相應的內參基因已經(jīng)被鑒定[16-18]。除了持家基因外，在轉錄組等數(shù)字測序技術中，基因表達變異系數(shù)通常用來評估基因表達差異的程度，CV值也可用于基因表達穩(wěn)定性評估[19-20]。本研究基于已有的轉錄組測序數(shù)據(jù)中基因表達變異系數(shù)，綜合多個分析結果篩選出Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）等穩(wěn)定表達內參。與已報道的研究相比，該結果在候選基因來源、評估方法、評估結果等方面具有一定的創(chuàng)新性。

本研究基于胡椒全基因組和轉錄組數(shù)據(jù)，通過在基因表達CV值的基礎上初步篩選了62個候選基因，候選基因的分析數(shù)量遠遠高于已報道的同類研究。geNorm的結果發(fā)現(xiàn)有40個候選基因均可滿足M<0.5的閾值，同時配對差異分析結果發(fā)現(xiàn)所有的Vn/Vn+1值均小于0.15，表明本研究候選基因整體質量較高。且候選基因的表達穩(wěn)定性要遠遠優(yōu)于已報道的胡椒內參基因，如Myeloid leukemia factor 1， Casein kinase，Beta-gala cto sidase。一般認為單一的內參基因往往無法滿足不同組織對于均一化的需求，在實際分析中，往往會篩選多個內參基因。geNorm配對變異系數(shù)分析建議采取2～3個內參組合用于分析。為驗證候選基因的實際效果，我們選擇了綜合評估最優(yōu)的Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）為內參基因，同時設定Pn3.100、Pn17.1212、Pn5.311作為組合內參基因，分析了供測基因表達情況，結果表明2種內參基因的分析結果高度一致，即本研究中鑒定的內參基因可以滿足胡椒不同組織中特異表達基因、果實發(fā)育相關基因和辣椒疫霉菌相應相關基因的表達模式分析。

總體而言，在數(shù)據(jù)結果上，本研究為胡椒分子生物學研究提供了理想的內參基因：Myeloid leukemia factor 1（Pn17.1212）。同時其他候選基因在針對不同的研究方向，如抗寒、抗病毒病、抗根結線蟲等研究時仍然具有重要的參考性。在分析方法上，我們認為候選基因的選擇不應僅局限于持家基因，基因組及數(shù)字化轉錄組測序數(shù)據(jù)的不斷完善是內參基因鑒定的重要數(shù)據(jù)來源，理想的內參基因可滿足不同組織的均一化要求。因此，針對不同的研究課題，系統(tǒng)全面地進行內參基因的鑒定仍然很有必要。

參考文獻

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