楊新周，劉貴有，梁建平，楊 琦 ，郭云膠 ，田孟華

(1.德宏師范高等專科學(xué)校民族醫(yī)藥研究所，云南 芒市 678400； 2. 德宏職業(yè)學(xué)院，云南 芒市 678400；3. 德宏州科技情報(bào)研究所，云南 芒市 678400； 4.昭通市天麻研究院，云南 昭通 657000)

【研究意義】凹紋胡蜂 (VespavelutinaaurariaSmith) 屬于膜翅目胡蜂總科胡蜂屬，民間俗稱葫蘆蜂、白腳蜂、吊包蜂等[1-2]，主要分布于中國云南、四川、西藏等地[2]，胡蜂全蟲可以入藥，可用于治療祛風(fēng)、解毒等[2-3]。其中胡蜂的成蟲、幼蟲、蜂毒已經(jīng)在食品、藥品、保健品和生物防治中有一定應(yīng)用[2]。2015版藥典記載蜂房具有祛風(fēng)、攻毒、殺蟲、止痛的功效[4]。隨著凹紋胡蜂人工養(yǎng)殖技術(shù)的成熟，蜂巢產(chǎn)量逐漸增多，但是對凹紋胡蜂蜂巢的開發(fā)鮮見研究，造成極大的浪費(fèi)，研究凹紋胡蜂蜂巢中黃酮、多酚、多糖的提取工藝、抗氧化活性，可為凹紋胡蜂蜂巢的綜合利用和進(jìn)一步的開發(fā)提供一定依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前蜂巢中黃酮、多酚及抗氧化活性的研究主要集中蜜蜂蜂巢，對于凹紋胡蜂蜂巢中黃酮、多酚、多糖的提取研究相對較少，凹紋胡蜂的研究主要集中于養(yǎng)殖，營養(yǎng)成分、重金屬含量、生物習(xí)性蜂毒藥效等。【本文研究切入點(diǎn)】本研究以凹紋胡蜂蜂巢為實(shí)驗(yàn)材料，通過單因素和正交試驗(yàn)探究出提取黃酮、多酚、多糖最佳實(shí)驗(yàn)條件，如乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間、料液比等條件的優(yōu)化。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過水浴回流提取-分光光度法同時(shí)提取、分析凹紋胡蜂蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖含量。探究出乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度、提取時(shí)間等因素對提取效果的影響。建立同時(shí)提取胡蜂蜂巢中黃酮、多糖、多酚的最佳工藝，揭示胡蜂蜂巢不同部分中黃酮、多糖、多酚的分布規(guī)律和蜂巢提取液的抗氧化活性能力，為開發(fā)胡蜂蜂巢抗氧化有效成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

凹紋胡蜂蜂巢由德宏師專食用藥用昆蟲研究所提供，并經(jīng)德宏師專郭云膠教授鑒定為胡蜂科凹紋胡蜂蜂巢，蜂巢樣品見圖1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 凹紋胡蜂蜂巢實(shí)驗(yàn)材料的制備 將采集的凹紋胡蜂蜂巢(巢脾、外殼、白色封膜)樣品，在40 ℃下烘12 h，粉碎，過0.3 mm篩子，貯存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 胡蜂蜂巢Fig.1 Vespa velutina auraria Smith hive

1.2.2 凹紋胡蜂蜂巢待測液的制備 在100 mL圓底燒瓶中加入胡蜂蜂巢樣品1.0000 g，按料液比1∶50(g/mL)加入乙醇溶液，水浴回流提取4 h，過濾，定容至50 mL得胡蜂蜂巢待測液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作和樣品測定 按照文獻(xiàn)[5]、[6]、[7]制作黃酮、多酚、多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，蘆丁(黃酮)標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0137X-0.04，R2=0.9997；多酚線性方程為：Y=0.1097X+0.0116，R2=0.9992；多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：Y= 0.0133X+ 0.0565，R2= 0.996。

分別移取蜂巢待測液2.0 、0.5 、0.1 mL代替蘆丁、沒食子酸、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照黃酮、多酚、多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定胡蜂蜂巢提取液吸光度，分別按照式(1)、(2)、(3)計(jì)算黃酮、多酚、多糖含量[5-9]。

黃酮含量=(C1×稀釋倍數(shù)×V)/1000/m

(1)

多酚含量=(C2×稀釋倍數(shù)×V)/1000/m

(2)

多糖含量=(C3×稀釋倍數(shù)×V)/1000/m

(3)

式中，C1、C2、C3分別為提取液總黃酮、多酚、多糖濃度，μg/mL；V為體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.4 單因素試驗(yàn) ①胡蜂蜂巢中黃酮、多酚、多糖提取效果與乙醇體積分?jǐn)?shù)間的關(guān)系：稱取凹紋胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50，分別加入20 %～100 %體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，80 ℃水浴回流提取3 h，過濾接著轉(zhuǎn)至50 mL容量瓶中定容，分別測定胡蜂巢脾提取液中的黃酮、多酚、多糖的濃度，并計(jì)算其含量。②胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與料液比間的關(guān)系：稱取凹紋胡蜂巢脾1 g，分別按料液比(1∶20～1∶60)加入60 %的乙醇溶液， 80 ℃水浴回流提取3 h，過濾轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中(料液比為1∶60樣品需濃縮)，定容，分別測定胡蜂巢脾提取液中的黃酮、多酚、多糖的濃度，并計(jì)算其含量。③胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與溫度之間的關(guān)系：稱取凹紋胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50加入60 %的乙醇溶液，分別置于不同溫度(60、70、80、90 ℃)水浴中回流提取3 h，過濾轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，分別測定胡蜂巢脾提取液中的黃酮、多酚、多糖的濃度，并計(jì)算其含量。④胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與時(shí)間之間的關(guān)系：稱取凹紋胡蜂巢脾1 g，按料液比1∶50加入60 %的乙醇溶液，80 ℃恒溫水浴中分別回流提取1、2、3、4、5 h，過濾轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中定容，分別測定胡蜂巢脾提取液中的黃酮、多酚、多糖的濃度，并計(jì)算其含量。

1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行4因素3水平正交試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.2.6 凹紋胡蜂蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖的測定 以優(yōu)化的提取條件，分別對凹紋胡蜂蜂巢巢脾、外殼、白色封膜進(jìn)行提取并測定其中的黃酮、多酚、多糖含量。

表1 因素和水平

1.2.7 抗氧化能力測定 (1)DPPH·自由基清除率:移取質(zhì)量濃度為24 μg/mL的 DPPH·溶液4.5 mL于10 mL比色管中，加入一定量胡蜂蜂巢脾提取液，無水乙醇定容至5 mL，避光放置0.5 h，在517 nm處測定其吸光度值，得A蜂，同法做空白試驗(yàn)，得A0。按照式 (4) 計(jì)算胡蜂蜂巢巢脾提取液清除率[5-6]。同法測定對照品抗壞血酸和凹紋胡蜂蜂巢外殼、白色封膜提取液清除DPPH·自由基活性能力。

DPPH·自由基清除率(%)=[(A0-A蜂)/A0]×100

(4)

(2)·OH自由基清除率:取不同體積的蜂巢提取液，加入蒸餾水至2.5 mL，依次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液0.5mL、8.8mmol/L H2O2溶液1.0 mL，置于37 ℃水浴中反應(yīng)0.5 h，冷卻至室溫，于波長λmax=510 nm處測定吸光度值得As。同法以0.5 mL蒸餾水代替水楊酸得對照組，吸光度為Ad，以2.5 mL蒸餾水代替樣品得空白組吸光度為Ak。同時(shí)以VC作為陽性對照[10-12]。

羥基自由基清除率(%)=[Ak-(As-Ad]/Ak×100

(5)

(3)總抗氧化能力的測定:取不同濃度的蜂巢提取液1 mL，依次加入0.6 mol/L硫酸溶液1mL，28 mmol/L磷酸鈉溶液1 mL，4 mmol/L鉬酸銨溶液1 mL，置于90 ℃水浴中加熱1.5 h，冷卻至室溫。在波長 695 nm 處測量吸光度。同法以1 mL蒸餾水代替蜂巢提取液作為空白對照，同時(shí)以VC為陽性對照[10,13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)與胡蜂蜂巢脾中黃酮、多酚、多糖提取效果間的關(guān)系

從圖2可見，胡蜂蜂巢脾中黃酮、多酚、多糖含量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60 %，三者含量下降，所以單因素實(shí)驗(yàn)中選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)為60 %。

2.2 胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與料液比間的關(guān)系

從圖3可以看出，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，胡蜂蜂巢脾中多糖含量最大為57.90 mg/g，料液比為1∶40時(shí)，胡蜂蜂巢脾中多糖含量為57.14 mg/g，兩者相差0.66 mg/g。當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，胡蜂蜂巢脾中黃酮、多酚含量最大。實(shí)驗(yàn)中為兼顧三者的含量，所以單因素實(shí)驗(yàn)選擇料液比為1∶50。

2.3 胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與溫度之間的關(guān)系

從圖4可見，胡蜂蜂巢脾中黃酮、多酚、多糖含量隨著溫度的升高而增大，當(dāng)溫度高于80 ℃時(shí)，三者含量開始降低，因此單因素實(shí)驗(yàn)中選擇溫度為80 ℃。

2.4 時(shí)間與胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果間的關(guān)系

從圖5可見，黃酮、多酚含量隨著提取時(shí)間的延長而增大，當(dāng)時(shí)間大于4 h，黃酮、多酚含量出現(xiàn)下降趨勢。多糖含量在3 h時(shí)，含量最大為57.95 mg/g，4 h時(shí)為57.33 mg/g，2個(gè)時(shí)間中多糖含量相差0.62 mg/g，但要兼顧黃酮、多酚的含量，綜合考慮單因素實(shí)驗(yàn)選擇提取時(shí)間為4 h。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)與胡蜂蜂巢脾中黃酮、多酚、多糖提取效果間的關(guān)系Fig.2 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and ethanol volume fraction

圖3 料液比與胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果間的關(guān)系Fig.3 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the ratio of solid to liquid

2.5 正交試驗(yàn)

從表2可以看出，以胡蜂蜂巢黃酮為指標(biāo)，4個(gè)影響因子極差R大小順序?yàn)锽>D>A>C；以胡蜂蜂巢多酚為指標(biāo)， R大小順序?yàn)镈>A>B>C； 以多糖為指標(biāo)，R大小順序?yàn)镈>A>C>B。A1B3C3D3組合中多酚和多糖含量最大，分別為20.09、59.15 mg/g，此時(shí)黃酮含量為13.75 mg/g;A2B3C1D2組合中黃酮含量最大為15.06 mg/g，而此時(shí)多酚和多糖含量分別為17.73、49.00 mg/g;與A1B3C3D3組合相比，多酚和多糖含量較低。所以綜合考慮黃酮、多酚、多糖含量，最佳提取工藝選擇A1B3C3D3。

2.6 胡蜂蜂巢不同部位黃酮、多酚、多糖分布情況

從表3可以看出，胡蜂蜂巢不同部位黃酮、多酚、多糖含量成分差異較大，其中中黃酮、多酚、多糖含量依次為巢脾>外殼>封口膜。蜂巢巢脾主要為胡蜂分泌物構(gòu)造而成是胡蜂主要居住場所，封口膜為胡蜂從體內(nèi)吐出的物質(zhì)構(gòu)成，而外殼主要為胡蜂應(yīng)用樹皮等材料構(gòu)造，因?yàn)闃?gòu)成基礎(chǔ)不同，導(dǎo)致了胡蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖含量差異。

圖4 溫度與胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果間的關(guān)系Fig.4 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the temperature

圖5 胡蜂蜂巢脾黃酮、多酚、多糖提取效果與時(shí)間之間的關(guān)系Fig.5 The relationship between the extraction effect of flavonoids, polyphenols and polysaccharides in the comb of Vespa velutina auraria Smith hive and the time

2.7 胡蜂蜂巢不同部位提取液抗氧化活性

2.7.1 DPPH·自由基清除率 測定了胡蜂蜂巢不同部位提取液清除 DPPH·自由基活性，并計(jì)算出清除 DPPH·自由基 IC50，通過研究發(fā)現(xiàn)，蜂巢巢脾、外殼、封口膜對DPPH·自由基活性具有一定的清除能力，實(shí)驗(yàn)得出外殼、巢脾、封口膜的清除DPPH·自由基IC50分別為0.27、0.073、0.64 mg/mL。Vc清除 DPPH·自由基IC50為0.0028 mg/mL。

2.7.2 ·OH自由基清除率 ·OH自由基十分活躍，能與體內(nèi)活性物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致其失活，甚至可致癌等[9]。實(shí)驗(yàn)中測試了胡蜂蜂巢不同部位提取液清除·OH自由基活性能力，并計(jì)算出清除·OH自由基 IC50，通過研究發(fā)現(xiàn)，蜂巢巢脾、外殼、封口膜對·OH自由基活性具有一定的清除能力，外殼、巢脾、封口膜的清除·OH自由基IC50分別為3.97、2.44、2.46 mg/mL。Vc清除·OH自由基IC50為0.10 mg/mL。

2.7.3 總抗氧化能力 本方法為磷鉬絡(luò)合物的測定方法，Mo(Ⅵ)被抗氧化劑還原為 Mo(Ⅴ)，生成綠色絡(luò)合物。在最大吸收波長695 nm 處，吸光度越高，物質(zhì)抗氧化活性越強(qiáng)[9]。實(shí)驗(yàn)得出，總抗氧化能力隨著提取液濃度的增大而升高。其中同種濃度下胡蜂不同部位的吸光度值大小為：蜂巢脾>蜂殼>封口膜。其中Vc濃度遠(yuǎn)小于胡蜂蜂巢不同部位提取液濃度，但其吸光度均高于胡蜂巢不同部位。說明胡蜂巢不同部位總抗氧化能力順序?yàn)閂c>蜂脾>蜂殼>封口膜。說明總氧化能力可能與胡蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖存在一定關(guān)系。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 黃酮、多酚、多糖在胡蜂蜂巢不同部位中的分布

3 討 論

蜂巢中黃酮、多酚、多糖隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(低于60 %)的升高而增大，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)高于60 %，三者含量降低，這可能與三者的極性有關(guān)。當(dāng)料液比大于1∶50時(shí)，三者含量降低，可能是隨著溶液體積的增加，溶液吸收了部分熱量，其余成分也被提取出來，導(dǎo)致三者含量減小。隨著提取時(shí)間的延長和提取溫度的升高，蜂巢中三者物質(zhì)被破壞，發(fā)生不可逆變化，三者含量下降。

凹紋胡蜂蜂巢巢脾主要為胡蜂分泌物構(gòu)造，封口膜為胡蜂從體內(nèi)吐出的物質(zhì)構(gòu)成，而外殼主要為胡蜂應(yīng)用樹皮、唾液等材料筑造，因?yàn)闃?gòu)成基礎(chǔ)不同，導(dǎo)致胡蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖含量存在差異，黃酮、多酚、多糖含量依次為巢脾>外殼>封口膜。蜂巢不同部位清除DPPH·自由基、·OH自由基、總抗氧化能力順序?yàn)槌财?外殼>封口膜。其抗氧化能力可能與黃酮、多酚、多糖含量有一定的關(guān)系。通過此研究，可為胡蜂蜂巢的開發(fā)提供一條途徑，為胡蜂蜂巢抗氧化活性物質(zhì)的分離奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，水浴回流同時(shí)提取胡蜂蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖的最佳提取條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)為 50 %，溫度85 ℃，時(shí)間3.5 h，料液比1∶35。根據(jù)優(yōu)化提取工藝測定了胡蜂蜂巢不同部位中黃酮、多酚、多糖含量，依次為巢脾>外殼>封口膜。測定了胡蜂蜂巢不同部位提取液抗氧化活性，外殼、巢脾、封口膜和Vc清除DPPH·自由基、·OH自由基、總抗氧化能力順序?yàn)閂c>巢脾>外殼>封口膜。說明胡蜂蜂巢具有一定的抗氧化活性，但均小于Vc。外殼、巢脾、封口膜3種成分的含量大小順序與其抗氧化活性能力一致，說明3種物質(zhì)的含量與抗氧化能力之間存在一定的聯(lián)系。