宋俏姮，孔亮亮，劉俊峰，楊躍華，張 垚，高必軍

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川 德陽(yáng) 618000)

【研究意義】甜加糯型玉米是滿足不同地區(qū)和不同人群對(duì)鮮食玉米品質(zhì)更高消費(fèi)需求的新類型，綜合了甜玉米和糯玉米優(yōu)點(diǎn)，入口“既甜又糯”，風(fēng)味營(yíng)養(yǎng)口感更佳，近些年已成為鮮食玉米選育的一個(gè)新方向[1-3]。在選育甜糯雙隱性玉米自交系的基礎(chǔ)上，通過(guò)與單或多隱性純合體雜交組配，即可獲得甜(雜結(jié)合)糯(純結(jié)合)的玉米雜交種，播種后收獲的果穗即為甜加糯型玉米[4]。因此，甜糯雙隱性玉米自交系是配制甜加糯型玉米的必備中間材料?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從遺傳連鎖關(guān)系上分析，甜質(zhì)基因與糯質(zhì)基因可轉(zhuǎn)育到同一自交系中，獲得甜糯雙隱性純合體[5]。甜質(zhì)基因在糖分累積和淀粉總量上具有隱性上位作用，甜糯雙隱性純合體的籽粒表現(xiàn)為甜質(zhì)，外觀和口感與甜玉米類似，僅憑肉眼觀察和品嘗難以準(zhǔn)確判斷[5-7]。常規(guī)甜、糯玉米雜交組配F1選擇分離比例為4/16的甜粒鑒定基因型，其中有1/16的甜糯雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)；F1選擇分離比例為3/16的糯粒繼續(xù)播種自交，其中2/3的果穗分離出3/4糯粒(Sh2-wxwx)，1/4表型為甜質(zhì)的雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)[4，8]，但F1挑選糯粒時(shí)易出現(xiàn)誤選，影響創(chuàng)制準(zhǔn)確性。甜、糯玉米染色體雜交手段可控性差、變異大[9]，需鑒定分離后代的基因型。SSR分子標(biāo)記鑒定法利用與目標(biāo)基因(waxy)緊密連鎖的遺傳標(biāo)記對(duì)特定性狀(糯性)基因型進(jìn)行選擇，可在后代群體中直接篩選出含有目標(biāo)基因(waxy)的甜糯雙隱性純合體(sh2sh2wxwx)[10]。李新海等報(bào)道了與糯質(zhì)基因(waxy)緊密連鎖的3對(duì)SSR引物(phi022、phi027、phi061)[11]。楊耀迥等基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選出的9株甜糯雙隱性玉米單株經(jīng)過(guò)4代連續(xù)自交，得到穩(wěn)定的甜糯雙隱性玉米自交系[12]。【本研究切入點(diǎn)】目前尚未見(jiàn)針對(duì)不同遺傳背景獲得的甜糯雙隱性玉米種質(zhì)進(jìn)行SSR鑒定的報(bào)道，亟需探索一種方便準(zhǔn)確的甜糯雙隱性玉米種質(zhì)鑒定體系，以簡(jiǎn)化育種程序，降低育種成本?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究利用與糯質(zhì)基因(waxy)緊密連鎖的3對(duì)SSR引物，將分子標(biāo)記鑒定技術(shù)應(yīng)用于3種不同遺傳背景獲得的甜糯雙隱性玉米材料的篩選中，旨在對(duì)比分析不同創(chuàng)制方法的準(zhǔn)確性和效果，解決選育甜糯雙隱性玉米自交系的技術(shù)瓶頸，為甜糯雙隱系的選擇提供更加簡(jiǎn)便、高效的方法，提高育種效率和育種的預(yù)見(jiàn)性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉米材料為YH03-01×HJ03-34，對(duì)照(CK)材料為H00-1。糯玉米自交系YH03-01、H00-1和超甜玉米自交系HJ03-34均為四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所自育。

1.2 方法

1.2.1 材料組配 常規(guī)甜、糯玉米雜交組配。選取優(yōu)良糯玉米自交系YH03-01與優(yōu)質(zhì)超甜玉米自交系HJ03-34雜交，雜交組合YH03-01×HJ03-34自交授粉1代，在果穗上選擇表型為甜質(zhì)的籽粒，種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所試驗(yàn)地，獲得84份供試材料；同時(shí)，在果穗上選擇表型為糯質(zhì)的籽粒，繼續(xù)播種自交1代，從收獲的果穗上挑取甜質(zhì)籽粒種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所試驗(yàn)地，獲得186份供試材料。

甜、糯玉米染色體雜交。親本糯玉米自交系YH03-01和超甜玉米自交系HJ03-34由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所提供，甜、糯玉米染色體雜交過(guò)程由深圳市百綠生物染色體雜交研究所完成，獲得84份供試材料。

1.2.2 DNA提取 在供試材料幼苗期(4～6葉)剪取嫩葉，以優(yōu)良糯玉米自交系H00-1的葉片作為對(duì)照(CK)，放入取樣袋并編號(hào)，迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。采用改良CTAB法提取玉米葉片總DNA。將新鮮葉片在液氮中速凍，研磨成粉末，轉(zhuǎn)入2 mL離心管中。加入65 ℃預(yù)熱的500 μl CTAB抽提液，使用前在CTAB中加入0.2 % β-巰基乙醇，輕輕混勻，在65 ℃水浴中溫浴30～60 min，期間每隔10 min顛倒混勻。加入500 μl的氯仿：異戊醇(24∶1)，輕輕充分混勻，10 000 r/min離心10 min。取上清至新的1.5 mL離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min，沉淀DNA。10 000 r/min離心10 min，棄廢液。用600 μl 70 %乙醇漂洗兩次，10 000 r/min離心2 min，室溫下干燥，根據(jù)DNA含量用超純水溶解。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，并將DNA樣品濃度稀釋至50 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR引物的選擇與確定 采用李新海等[11]報(bào)道的與糯玉米隱性基因(waxy)緊密連鎖的3對(duì)SSR標(biāo)記引物：phi022、phi027、phi061。在MaizeGDB上搜索其引物序列，由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。用優(yōu)良糯玉米自交系YH03-01(母本)驗(yàn)證是否能成功標(biāo)記，標(biāo)記成功的引物用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)在美國(guó)Applied Biosystems公司生產(chǎn)的GeneAmp-9700 PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為20 μl：其中包括2.5 U/μlTaqDNA聚合酶0.25 μl，10×TaqBuffer 2.00 μl，25 mM MgCl22.00 μl，2.5 mM dNTP
1.50 μl，5 μM SSR引物2.00 μl，50 ng/μl DNA模板1.50 μl，ddH2O 10.75 μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用10 %非變性聚丙烯酰胺凝膠在120 W恒功率下電泳分離1 h后，按照銀染程序進(jìn)行固定、漂洗、染色、漂洗、顯影，最后拍照保存。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳結(jié)果中與對(duì)照(優(yōu)良糯玉米自交系)具有相同條帶的即為含有目標(biāo)基因waxy的樣品，在田間對(duì)應(yīng)編號(hào)的植株即為甜糯雙隱性sh2sh2wxwx玉米單株。不同遺傳背景的供試材料獲得甜糯雙隱性玉米單株的比例采用下列公式分別計(jì)算。甜糯雙隱性純合體比例=(同一背景獲得的甜糯雙隱性植株數(shù)/同一背景獲得的供試植株數(shù))×100 %。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度和質(zhì)量

模板DNA的濃度和質(zhì)量與PCR擴(kuò)增結(jié)果密切相關(guān)。模板DNA濃度，特別是其中待擴(kuò)增目的基因的原始拷貝數(shù)以及DNA的純度、長(zhǎng)度和完整性是影響PCR擴(kuò)增效率和特異擴(kuò)增片段檢出率的重要因素。從圖1可知，本試驗(yàn)提取的玉米葉片總DNA質(zhì)量和純度較高，濃度適宜，長(zhǎng)度完整，可用于后續(xù)PCR擴(kuò)增。

2.2 SSR引物檢測(cè)

以優(yōu)良糯玉米自交系YH03-01(母本)DNA為模板，對(duì)與糯玉米隱性基因(waxy)緊密連鎖的3對(duì)SSR引物phi022、phi027、phi061進(jìn)行選擇與確定。從圖2可知，3對(duì)SSR引物對(duì)糯質(zhì)親本的擴(kuò)增條帶清晰單一，且處于同一遷移率位置，均能成功標(biāo)記。

圖1 部分DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Detection results of partial DNA agarose gel electrophoresis

2.3 SSR標(biāo)記結(jié)果分析

以優(yōu)良糯玉米自交系H00-1為對(duì)照(CK)，利用phi022、phi027、phi061對(duì)3種不同遺傳背景獲得的354份材料進(jìn)行SSR甜糯雙隱基因型鑒定。PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示：①引物phi027在354份供試材料與對(duì)照CK間無(wú)明顯多態(tài)性。②引物phi022對(duì)常規(guī)甜、糯雜交F1在甜質(zhì)背景下選育的84份材料和F1在糯質(zhì)背景下選育的186份材料擴(kuò)增出來(lái)的帶型完整清晰，重復(fù)性好，可明顯標(biāo)記基因型(圖3)；用于甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料，擴(kuò)增條帶則較為模糊。③引物phi061對(duì)甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖譜條帶穩(wěn)定清晰，可直接判斷目標(biāo)基因是否存在；而用于常規(guī)甜、糯雜交F1在甜質(zhì)背景下選育的84份材料和F1在糯質(zhì)背景下選育的186份材料，擴(kuò)增條帶模糊不清，或者材料與對(duì)照CK間無(wú)多態(tài)性。

由于SSR標(biāo)記的共顯性特征，可分辨純合基因型個(gè)體或雜合基因型個(gè)體，根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果：①利用引物phi022，常規(guī)甜、糯雜交F1在甜質(zhì)背景下選育的84份材料中與對(duì)照CK處于同一位點(diǎn)的樣品有16個(gè)，在田間對(duì)應(yīng)編號(hào)的植株即為甜糯雙隱性純合基因型sh2sh2wxwx玉米單株，甜糯雙隱基因型純合體的比例為19.05 %，甜質(zhì)純合基因型sh2sh2WxWx玉米材料19份，甜質(zhì)雜合基因型sh2sh2Wxwx玉米材料為49份。②利用引物phi022，F(xiàn)1在糯質(zhì)背景下選育的186份材料的擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳結(jié)果中與對(duì)照CK均具有相同的圖譜條帶，即此遺傳背景下甜糯雙隱性純合體的比例為100.00 %。③利用引物phi061，鑒定出甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料中有39份甜糯雙隱基因型玉米純合體，38份甜質(zhì)純合基因型sh2sh2WxWx材料，7份甜質(zhì)雜合基因型sh2sh2Wxwx材料，甜糯雙隱基因型純合體的比例為46.43 %。SSR鑒定選擇出的甜糯雙隱性玉米種質(zhì)連續(xù)套袋自交，可進(jìn)一步純化繁殖成甜糯雙隱性玉米自交系，有效簡(jiǎn)化育種程序、降低育種成本。

3 結(jié)論與討論

甜糯雙隱性玉米籽粒表型為甜質(zhì)，默認(rèn)其含有甜質(zhì)基因，本研究基于SSR分子標(biāo)記鑒定技術(shù)，利用與糯玉米隱性基因waxy緊密連鎖的SSR標(biāo)記引物phi022、phi027、phi061，篩選出含有糯質(zhì)基因的個(gè)體，即為甜糯雙隱性玉米種質(zhì)。楊耀迥等[12]利用這3對(duì)SSR引物對(duì)S1甜質(zhì)家系篩選甜糯雙隱性玉米種質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，引物phi022擴(kuò)增效果較好，并成功鑒定出9株甜糯雙隱性玉米單株，而phi027和phi061擴(kuò)增條帶模糊甚至殘缺不全。宮捷等[13]使用同樣的3對(duì)SSR引物在3份糯玉米自交系L33、L35和L38和1份甜玉米骨干系M01之間進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，引物phi022和phi027在親本間無(wú)差異，而引物phi061條帶清晰完整且有明顯多態(tài)性，可用來(lái)鑒定sh2sh2wxwx甜糯雙隱性純合體。本研究中3對(duì)SSR引物對(duì)糯質(zhì)親本的擴(kuò)增條帶清晰單一，且處于同一遷移率位置，引物phi022可成功標(biāo)記常規(guī)甜、糯雜交F1在甜質(zhì)背景下選育的84份材料和F1在糯質(zhì)背景下選育的186份材料的基因型，但用于染色體雜交手段獲得材料的標(biāo)記時(shí)則較模糊；引物phi061對(duì)甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料可明顯判斷目標(biāo)基因是否存在，用于常規(guī)甜、糯雜交獲得的材料時(shí)條帶模糊不全，或材料與對(duì)照CK間無(wú)多態(tài)性；引物phi027在354份供試材料與對(duì)照CK間無(wú)多態(tài)性。結(jié)合影響分子標(biāo)記鑒定效果的因素分析，材料的遺傳背景，性狀的遺傳率，標(biāo)記定位精度以及與目標(biāo)基因連鎖程度，標(biāo)記的特異性和在材料間的多態(tài)性，PCR反應(yīng)條件，均可影響檢測(cè)的準(zhǔn)確性和效率以及性狀對(duì)MAS的響應(yīng)[14]。

圖3 引物phi022部分?jǐn)U增產(chǎn)物圖譜Fig.3 Electrophoresis of partial amplified products with primer phi022

常規(guī)甜、糯玉米雜交組配是創(chuàng)制雙隱性材料最常用的方法之一[5]，甜、糯玉米雜交后獲得普通玉米(Sh2sh2Wxwx)種子，后代植株選株自交或彼此交，依據(jù)遺傳自由組合定律，F(xiàn)1果穗上有9/16普通玉米籽粒(Sh2-Wx-)、3/16糯質(zhì)籽粒(Sh2-wxwx)、4/16甜質(zhì)籽粒[8]。其中4/16的甜粒中有1/16的甜糯雙隱性玉米籽粒(sh2sh2wxwx)，3/16超甜玉米籽粒(sh2sh2Wx-)，甜糯雙隱性籽粒占甜粒數(shù)的25 %。本研究F1在甜質(zhì)背景下選育的84份材料中鑒定出16份甜糯雙隱性材料，比例為19.05 %，與理論值近似，差值部分推測(cè)為甜糯雙隱性材料種子活力差、出苗率低，出苗數(shù)低于播種數(shù)造成。蘇彩霞等[4]研究發(fā)現(xiàn)常規(guī)甜、糯玉米雜交F1果穗上3/16的糯粒播種自交1代后，1/3的果穗表現(xiàn)全糯(Sh2Sh2wxwx)，2/3的果穗分離出3/4糯質(zhì)籽粒(Sh2-wxwx)，1/4表型為甜質(zhì)的雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)，甜糯雙隱性籽粒占甜粒比例為100 %。本研究F1在糯質(zhì)背景下選育的186份材料中標(biāo)記出186份甜糯雙隱性材料，即此遺傳背景下甜糯雙隱性純合體的比例為100 %，與理論值吻合。目前尚未見(jiàn)通過(guò)甜、糯玉米染色體雜交手段獲得雙隱性材料的相關(guān)報(bào)道，筆者委托深圳市百綠生物染色體雜交研究所以糯玉米作供體制成染色體片段導(dǎo)入甜玉米(受體)細(xì)胞，被導(dǎo)入的染色體片段和受體細(xì)胞內(nèi)原有的染色體發(fā)生融合雜交，再通過(guò)組織培養(yǎng)和篩選獲得一批材料，為驗(yàn)證此創(chuàng)制方法的可行性，對(duì)獲得的84份材料進(jìn)行了SSR鑒定，其中甜糯雙隱性玉米純合體有39份，比例為46.43 %。本研究結(jié)果表明不同遺傳背景獲得雙隱性材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，常規(guī)甜、糯雜交F1果穗上選擇甜粒所需代次少，分離比例較高，但外觀難以與甜粒區(qū)分，須鑒定基因型，增加工作環(huán)節(jié)；F1果穗上選擇糯粒，該背景獲得雙隱性籽粒所需代次較多，分離比例低，但可省略鑒定環(huán)節(jié)。甜、糯染色體雜交技術(shù)可控性差，分離比例變異大，還需進(jìn)一步觀察該技術(shù)的成熟度。

目前對(duì)于甜糯雙隱性玉米材料的研究仍處于探索階段，快速準(zhǔn)確的判斷甜糯雙隱性玉米是開展后續(xù)工作的前提。在鑒定過(guò)程中，育種者普遍采用糯玉米作為測(cè)驗(yàn)種判斷甜糯雙隱性玉米種質(zhì)[15]，但測(cè)交鑒定法依賴于植株的表型選擇，容易受外界環(huán)境影響，工序繁瑣，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，工作量大，效率低。SSR分子標(biāo)記技術(shù)可通過(guò)與目標(biāo)基因緊密連鎖或共分離的功能標(biāo)記直接鎖定目標(biāo)基因，簡(jiǎn)便快速、遺傳穩(wěn)定，已廣泛應(yīng)用于作物的遺傳改良和聚合育種[16-17]。分子標(biāo)記鑒定法對(duì)基因型直接進(jìn)行選擇，不受環(huán)境、發(fā)育時(shí)期和基因表達(dá)等因素限制，與傳統(tǒng)測(cè)交鑒定相比具有顯著優(yōu)勢(shì)，極大的提高了選擇效率，但SSR分子標(biāo)記鑒定法不能脫離常規(guī)育種手段單獨(dú)使用。因此構(gòu)建飽和的分子標(biāo)記遺傳圖譜，提高定位精度，尋找到背景選擇適宜的標(biāo)記，利用目標(biāo)基因兩側(cè)連鎖的分子標(biāo)記同時(shí)進(jìn)行選擇[18]，并根據(jù)育種需要結(jié)合傳統(tǒng)鑒定方法和創(chuàng)新不同的鑒定手段，可顯著提高甜糯雙隱性玉米自交系的選擇效率和準(zhǔn)確性。