栗 揚 姚露花 郭 欣 趙 曉 黃 蕾 王登科 張學(xué)風(fēng) 肖前林 楊瑞吉 郭彥軍

三種豆科綠肥作物莖和葉角質(zhì)層蠟質(zhì)化學(xué)組成分析

栗 揚 姚露花 郭 欣 趙 曉 黃 蕾 王登科 張學(xué)風(fēng) 肖前林 楊瑞吉 郭彥軍*

西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院, 重慶 400716

植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是一類覆蓋于植物表層的疏水有機化合物, 在保護植物免受生物與非生物逆境脅迫中發(fā)揮著重要作用。為了更好地了解和認(rèn)識角質(zhì)層蠟質(zhì)在夏季綠肥作物抗逆性中的作用, 選擇檉麻()、田菁()和竹豆() 3種夏季豆科綠肥作物, 鑒定莖和葉蠟質(zhì)組分, 并分析蠟質(zhì)總量、各組分含量及碳鏈分布特征。共鑒定出8類化合物, 包括脂肪酸、初級醇、醛、烷烴、烷基酯、二醇、萜類和固醇類化合物, 其中前4種以同系物形式存在且為所有植物莖和葉共有成分(檉麻莖中未檢出脂肪酸), 說明烷合成和醇合成途徑是主要的2種蠟質(zhì)合成途徑。田菁莖中鑒定出二醇化合物, 其結(jié)構(gòu)初步解析為1,18-30烷醇和1,16-30烷醇。3種綠肥作物莖和葉蠟質(zhì)總量存在顯著種間及部位差異, 其中檉麻莖蠟質(zhì)總含量為16.33 μg cm-2, 顯著高于田菁莖(6.45 μg cm-2)和竹豆莖(0.72 μg cm-2)。就莖和葉比較, 檉麻莖顯著高于葉片, 其他2種植物莖和葉之間無顯著差異。檉麻莖蠟質(zhì)中, 烷烴為優(yōu)勢成分, 占蠟質(zhì)總量的57.38%; 葉片以初級醇為優(yōu)勢成分, 占蠟質(zhì)總量的50.12%。田菁莖、葉蠟質(zhì)中的優(yōu)勢成分均為初級醇, 分別占總蠟質(zhì)的30.12%和71.21%。竹豆莖、葉蠟質(zhì)中的優(yōu)勢成分均為烷烴, 分別占總蠟質(zhì)的40.79%和39.27%。各組分優(yōu)勢化合物的碳鏈長度在不同物種、不同部位也存在一定差異, 說明參與蠟質(zhì)合成的基因在物種、器官間有所不同。這些結(jié)果為今后從分子水平上揭示角質(zhì)層蠟質(zhì)參與夏季綠肥作物抗逆機制提供了理論基礎(chǔ)。

角質(zhì)層蠟質(zhì); 綠肥作物; 檉麻; 田菁; 竹豆

綠肥作物種植于主要作物種植間隙, 是一類以改良土壤質(zhì)量為目的的植物, 其中以豆科綠肥作物利用較廣[1]。豆科綠肥作物既可通過生物固氮增加土壤中的氮素, 也可通過翻埋入土, 以綠肥的形式改良土壤質(zhì)量。然而, 相較于糧食作物, 對夏季綠肥作物基本理化特性的認(rèn)識尚不足, 相關(guān)研究文獻也少, 制約了研究者對這些綠肥作物的開發(fā)利用。因此, 了解夏季綠肥作物的抗性生理指標(biāo), 可為提高這類作物的抗逆性、降低田間管理成本提供理論依據(jù)。

植物角質(zhì)層蠟質(zhì)是植物與外界環(huán)境的第一接觸面, 在保護植物免受生物及非生物脅迫的侵害、提高抗逆性方面發(fā)揮著非常重要的作用[2]。如干旱脅迫下, 植物葉角質(zhì)層蠟質(zhì)含量的增加被認(rèn)為與提高植物的抗旱性有關(guān)[3]。隨著紫外線輻射強度的變化, 角質(zhì)層蠟質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)也隨之發(fā)生變化, 以通過反射減少紫外線傷害[4]。角質(zhì)層蠟質(zhì)中的醛類物質(zhì)被認(rèn)為與病原菌的侵染有關(guān)[5]。此外, 朱命煒等[6]和韋存虛等[7]應(yīng)用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)成熟蘆薈()和星星草()葉表面分布有密集的瘤狀蠟質(zhì), 能有效地減少水分散失和增強葉片反射光輻射的能力。目前的研究結(jié)果表明, 植物角質(zhì)層蠟質(zhì)主要由長鏈脂肪酸及其衍生物組成, 如醛類、初級醇、酯類、烷烴、次級醇、酮, 及支鏈醇、支鏈烷烴、三萜醇、雙酮、烯烴、二醇和酮醇等物質(zhì)[8]。植物種類不同, 其所含的角質(zhì)層蠟質(zhì)組分也不同, 如油菜()和番茄()以烷類物質(zhì)為優(yōu)勢成分, 紫花苜蓿()、玉米()以初級醇為優(yōu)勢成分[9], 羊草()以二酮為優(yōu)勢成分[10]。蠟質(zhì)組分的品種差異說明參與角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成及轉(zhuǎn)運的途徑也可能存在差異[11]。角質(zhì)層蠟質(zhì)的合成, 首先在細(xì)胞質(zhì)中由可溶性的脂肪酸合成酶催化從頭合成16C/18C的飽和脂肪酸, 然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中由脂肪酰-CoA延長酶催化16C/18C的脂肪酸延長產(chǎn)生不同鏈長的長鏈脂肪酸。脂肪酰-CoA延長酶是一個多酶復(fù)合體, 包括β-酮脂酰-CoA合酶(3-ketoacyl- CoA synthase, KCS)、β-酮脂酰-CoA還原酶(3-ketoacyl-CoA reductase, KCR)、β-羥脂酰-CoA脫水酶(3-hydroxacyl-CoA dehydratase, HCD)和反式烯脂酰-CoA還原酶(trans-2,3-enoyl-CoA reductase, ECR)。基于蠟質(zhì)組分分析及基因功能驗證, 目前已證實, 角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成主要包括脫羰基途徑(烷合成途徑)、酰基還原途徑(初級醇合成途徑)和聚酮合酶途徑(polyketide synthase, PKS)[12]。如在擬南芥()中已鑒定出參與蠟質(zhì)合成的21個基因、參與合成次級醇和酮的MAH1基因及參與烷基酯合成的基因[12], 在小麥()與大麥()中鑒定出參與β-二酮合成的基因[13]。挖掘蠟質(zhì)合成基因已被作為選育抗逆作物材料的方法之一[9]。如在紫花苜蓿中的超表達(dá), 顯著增加了烷烴含量, 提高了植株的抗旱性[13],在水稻()中參與了初級醇的合成, 并可提高水稻抗旱性[15]。

檉麻()、竹豆()、田菁()是生產(chǎn)中常用的幾種夏季豆科綠肥作物。檉麻與玉米間作, 可顯著提高玉米地上部產(chǎn)量[16]。在松嫩平原鹽堿土, 隨著田菁生物量增加, 土壤pH、可溶性鹽含量逐年降低, 有機質(zhì)含量、堿解氮含量逐年升高[17]。幼齡果園套種竹豆綠肥與清耕相比, 可減少徑流70％、泥沙80％以上, 對改善園地土壤水肥, 促進幼樹生長有明顯的促進作用[18]。目前尚無這些綠肥作物角質(zhì)層蠟質(zhì)方面的研究報道。鑒于此, 本試驗從田間采集檉麻、田菁和竹豆葉片及莖稈, 利用色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定了蠟質(zhì)組分, 用氣相色譜對蠟質(zhì)組分進行了定量分析, 并計算了各組分相對含量及碳鏈分布特征, 為進一步挖掘這些植物的蠟質(zhì)合成基因, 提高夏季豆科綠肥作物抗逆性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地位于西南大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科技學(xué)院實驗農(nóng)場(29°48′N, 106°24′E), 屬亞熱帶季風(fēng)性濕潤氣候,年平均氣溫為18.2°C, 降水量為1084.6 mm。夏季綠肥作物生長季(4月至9月)月平均氣溫分別為18.9°C、22.5°C、25.3°C、28.6°C、28.5°C和24.3°C; 平均降水量分別為94.6、144.2、206.3、169.4、128.6和126.6 mm; 月平均日照時數(shù)分別為96.8、103.8、97.2、162.5、164.3和104.7 h (1988—2017年)。供試土壤為粘質(zhì)黃壤, 0~20 cm土壤耕層pH 6.37, 含有機質(zhì) 12.4 g kg-1、全氮0.73 g kg-1、全磷0.12 g kg-1、全鉀3.32 g kg-1、堿解氮67.4 mg kg-1、速效磷8.6 mg kg-1、速效鉀82.5 mg kg-1。

1.2 綠肥作物

供試綠肥作物包括檉麻()、竹豆()和田菁()。種子經(jīng)消毒(10% H2O2)后, 直接播在田間。設(shè)置9個小區(qū), 小區(qū)面積10 m2(2 m×5 m), 每個品種3個小區(qū)(重復(fù)), 隨機區(qū)組排列。播種時, 行距40 cm, 株距30 cm。等幼苗出土1周后, 開始間苗, 每小區(qū)留苗76株。定期除雜, 不澆水(靠雨水)。待植物進入現(xiàn)蕾期開始采樣分析。因竹豆在重慶地區(qū)開花較遲且少, 采樣時只有少數(shù)植株有花蕾。

1.3 蠟質(zhì)提取

分別采集每個小區(qū)各植物不同植株相同葉位葉片5片, 同時按留茬5 cm刈割后, 剪取莖段。提蠟前, 利用WinFOLIA專業(yè)組織圖像分析系統(tǒng)(Regent Instrument Inc, Canada)和數(shù)字化掃描儀(EPSON V750, Japan)測定莖、葉的正投影面積, 而3種豆科綠肥作物的莖可近似看作圓柱體, 故莖、葉面積可通過以下公式進行計算。

葉片面積= 2×投影面積

莖稈表面積= π×投影面積

每個小區(qū)葉片和莖稈樣品, 在室溫條件下分別用含5 μg內(nèi)標(biāo)(24烷)的氯仿(5 mL)渦旋浸提3次, 每次30 s。提取液混合后經(jīng)40°C氮氣吹干, 加入20 μL BSTFA [N,O-Bis (三甲基硅烷基)三氟乙酰胺])和20 μL吡啶, 于70°C衍生反應(yīng)45 min, 多余衍生劑用氮吹儀再次吹干。將所得提取物溶于1 mL氯仿, 進行氣相色譜和質(zhì)譜分析。

1.4 氣相色譜－質(zhì)譜(GC-MS)分析

采用9790II氣相色譜儀(浙江福立)分析蠟質(zhì)含量。色譜柱為DM-5 (5%二苯基 + 95%二甲基聚硅氧烷固定液), 毛細(xì)管柱長30 m, 直徑0.32 mm, 液膜厚度0.25 μm。氮氣作為載氣; 進樣量為1.0 μL; 柱膜和FID檢測器的溫度分別為300°C和320°C; 分流比為10︰3。初始溫度為80°C, 以每分鐘15°C的速度升溫至260°C, 并保持10 min, 之后以每分鐘2°C升溫至290°C, 保持1 min; 再以每分鐘5°C的速度升溫至320°C, 并保持10 min。利用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀(GCMS-AOC-5000 Plus)鑒定蠟質(zhì)組分, 程序升溫方式同色譜分析。鑒定成分時主要根據(jù)離子峰質(zhì)荷比(m/z)結(jié)合已發(fā)表相關(guān)成分質(zhì)譜圖, 解析化合物結(jié)構(gòu)。基于FID峰值量化蠟質(zhì), 根據(jù)質(zhì)譜所鑒定的標(biāo)準(zhǔn)確定色譜中各種化學(xué)成分的出峰位置, 用內(nèi)標(biāo)計算出植物單位面積的實際蠟質(zhì)含量, 單位為μg cm-2。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)為3個重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用SPSS(17.0)統(tǒng)計軟件, 利用單因素方差分析(One- Way ANOVA)比較不同作物莖、葉的蠟質(zhì)總含量、蠟質(zhì)各組分含量及鏈長分布特征, 顯著性檢驗水平為= 0.05 (l.s.d.)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟質(zhì)組分鑒定

以質(zhì)譜分析獲得化合物離子峰質(zhì)荷比(m/z), 再結(jié)合文獻中對蠟質(zhì)成分的鑒定質(zhì)譜圖, 從檉麻莖中鑒定出5類物質(zhì), 包括脂肪酸、初級醇、醛類、烷烴和萜類化合物, 葉片中鑒定出4類物質(zhì), 包括初級醇、醛類、烷烴和萜類化合物。田菁莖中發(fā)現(xiàn)7類物質(zhì), 包括脂肪酸、初級醇、烷基酯、醛類、烷烴、二醇、萜類和固醇類化合物, 葉片中鑒定出5類物質(zhì), 包括脂肪酸、初級醇、醛類、烷烴和萜類。其中二醇為1,18-30烷醇和1,16-30烷醇, 其中1,16-30烷醇離子峰構(gòu)成為m/z 73(100%)、103(38%)、149(59%)、285(23%)、299(63%)、313(25%)、387(8%)、401(15%)、415(6%)、598(質(zhì)量峰)(圖1)。竹豆莖和葉中均鑒定出5類物質(zhì), 包括脂肪酸、初級醇、醛類、烷烴和萜類。檉麻和田菁莖和葉均有低于10%左右的成分未能被鑒定, 而竹豆莖和葉中未鑒定成分高達(dá)30%左右。

2.2 莖、葉蠟質(zhì)總量及組分相對含量分析

檉麻、田菁、竹豆3種綠肥作物的莖、葉蠟質(zhì)總含量存在顯著種間及部位差異, 其中檉麻莖蠟質(zhì)總含量為16.33 μg cm-2, 顯著高于田菁莖(6.45 μg cm-2)和竹豆莖(0.72 μg cm-2)(圖2)。就莖和葉比較, 檉麻莖顯著高于葉片, 其他2種植物莖和葉之間無顯著差異。

檉麻莖蠟質(zhì)中, 烷烴為優(yōu)勢成分, 占蠟質(zhì)總量的57.38%, 其次是初級醇, 占14.23%, 脂肪酸占11.23%, 醛類和萜類化合物均低于7%, 未鑒定蠟質(zhì)組分約占2.96% (圖3)。葉片中初級醇為優(yōu)勢成分, 占蠟質(zhì)總量的50.12%, 醛類和萜類化合物分別占12.77%和15.95%, 而烷烴比例只有5.26%, 約12.45%的成分未能鑒定出來。

圖1 田菁莖蠟質(zhì)中雙醇化學(xué)結(jié)構(gòu)分析

A: 1,18 -30雙醇; B: 1,16 30-雙醇。

A: C30 1,18-alkanediol; B: C30 1,16-alkanediol.

田菁莖、葉蠟質(zhì)中的優(yōu)勢成分均為初級醇, 其中莖中占總蠟質(zhì)的30.12%, 而葉中高達(dá)71.21%。其次是醛類, 莖和葉中分別占總蠟質(zhì)的22.89%和19.39%(圖4)。莖中發(fā)現(xiàn)的二醇, 所占比例為3.58%, 烷基酯比例為0.44%。脂肪酸、烷烴和三萜類物質(zhì)在莖和葉中比例分別為7.99%和3.86%、6.59%和3.29%、14.63%和0.11%。另外, 莖和葉中均有8.55%和2.13%的未知成分。

圖2 檉麻、田菁、竹豆的莖和葉蠟質(zhì)總量

數(shù)據(jù)柱上不同小寫字母表示品種內(nèi)差異顯著(< 0.05)。

Different lowercase letters above the data bar within each species represent significant difference at< 0.05.

圖3 檉麻莖和葉中主要蠟質(zhì)組分實際含量

竹豆莖、葉蠟質(zhì)中的優(yōu)勢成分均為烷烴, 分別占總蠟質(zhì)的40.79%和39.27%。其次莖中分別為醛(25.28%)、初級醇(12.18%)和三萜類(2.61%), 葉中三類組分的比例分別為8.34%、3.75%和12.69% (圖5)。莖和葉中均有小于2%的脂肪酸, 以及17.22%和22.66%的未知成分。

圖4 田菁莖和葉主要蠟質(zhì)組分實際含量

圖5 竹豆莖和葉主要蠟質(zhì)組分實際含量

2.3 碳鏈分布特征分析

不同綠肥作物中發(fā)現(xiàn)的蠟質(zhì)組分多數(shù)以同系物的形式存在, 如脂肪酸和初級醇均為不同鏈長的偶數(shù)碳分子, 而醛和烷烴為奇數(shù)和偶數(shù)碳共存的化合物, 且烷烴表現(xiàn)為明顯的奇數(shù)優(yōu)勢, 醛表現(xiàn)為偶數(shù)優(yōu)勢。

2.3.1 檉麻主要蠟質(zhì)組分碳鏈分布特征 檉麻莖中脂肪酸碳鏈分布在C20~C32之間, 其中以C30為優(yōu)勢組分, 占總脂肪酸的33.33%, 其次為C32, 占22.20% (圖6)。初級醇碳鏈分布莖中在C22~C34之間, 葉中在C24~C32之間, 二者均以C28為優(yōu)勢組分, 分別占總初級醇的45.34%和68.66%; 莖中含有較高比例的C32, 達(dá)到31%, 而葉中只有0.14%。莖和葉中醛的碳鏈分布存在較大差異, 莖中以C32為優(yōu)勢組分(52.13%), 葉中以C30為優(yōu)勢組分(70.83%)。烷烴鏈長在C25~C33之間, 莖和葉均以C31為優(yōu)勢組分, 分別占總烷烴的79.49%和59.56%。萜類物質(zhì), 莖和葉中均以羽扇豆醇為最高(80%左右), 其中莖中還有20%左右a-香樹脂醇, 葉中有15%左右的乙?；鹕榷勾肌?/p>

2.3.2 田菁主要蠟質(zhì)組分碳鏈分布特征 田菁莖和葉中的脂肪酸碳鏈分布范圍在C20~C32, 其中莖中以C30為優(yōu)勢組分(68.35%), 而葉中以C26為優(yōu)勢組分(30.15%)(圖7)。初級醇碳鏈分布在莖和葉中差異較大, 其中莖中在C26~C32, 葉中在C22~C32, 但2個部位均以C30為優(yōu)勢組分, 分別占83.05%和73.25%。醛碳鏈分布莖中在C28~C34, 葉中在C28~C32, 2個部位均以C30為優(yōu)勢組分, 分別占46.96%和52.53%。烷碳鏈分布莖中在C25~C33, 葉中在C25~C31, 2個部位均以C29為優(yōu)勢組分, 分別占41.77%和51.18%。莖中所鑒定的二醇為C30同分異構(gòu)體, 其中1,18-30烷醇占27.91%, 1,16-30烷醇占72.09%。莖中發(fā)現(xiàn)的萜類物質(zhì)為β-香樹脂醇和羽扇豆醇, 而葉中只有β-香樹脂醇。

2.3.3 竹豆主要蠟質(zhì)組分碳鏈分布特征 竹豆莖和葉中脂肪酸碳鏈分布均在C22~C30之間, 且均以C28為優(yōu)勢組分(60%左右)(圖8)。初級醇碳鏈分布, 莖中在C24~C30, 葉中在C24~C34, 其中莖中以C28為優(yōu)勢組分(68.75%), 葉中以C32為優(yōu)勢組分(60.38%)。莖中醛碳鏈在C28~C32, 其中C30為優(yōu)勢組分(88.75%), 而葉中只有C28醛。莖和葉中烷烴碳鏈分布均在C25~ C33之間, 且均以C31為優(yōu)勢組分, 分別占40.75%和60.26%。莖和葉中的萜類物質(zhì)均為β-香樹脂醇和羽扇豆醇, 其中莖以β-香樹脂醇為優(yōu)勢組分(73.69%), 葉以羽扇豆醇為優(yōu)勢組分(72.97%)。

圖6 檉麻莖和葉蠟質(zhì)各組分同系物相對含量

圖7 田菁莖和葉蠟質(zhì)各組分同系物相對含量

3 討論

3種豆科綠肥作物的莖和葉中均含有脂肪酸、初級醇、醛類和烷烴,且這些組分含量總和占總蠟質(zhì)含量的比例超過60%。說明烷合成途徑和醇合成途徑是這些植物合成角質(zhì)層蠟質(zhì)的主要途徑。這與在其他主要作物上的發(fā)現(xiàn)是一致的[9]。然而,蕨類植物葉角質(zhì)層蠟質(zhì)以烷基酯為優(yōu)勢成分[19], 羊草以二酮為優(yōu)勢成分[10]。這些結(jié)果暗示了, 在長期進化過程中, 不同植物為適應(yīng)不同的生存環(huán)境其角質(zhì)層蠟質(zhì)生物合成產(chǎn)生了不同的進化方向。此外,我們還發(fā)現(xiàn)田菁莖和葉中的蠟質(zhì)組分存在較大差異, 有些成分只出現(xiàn)在葉片, 如二醇和固醇類物質(zhì), 其中二醇為1,18-30烷醇和1,16-30烷醇。在高山罌粟()葉片中也鑒定出C-30的二醇同系物, 但其羥基位置在1,11[20], 在蓖麻()葉片中,鑒定出鏈長C-22到C-28、羥基位置在1,3的二醇同系物[21]。Busta和Jetter[22]認(rèn)為這些碳鏈一頭為初級醇、碳鏈中間存在另一個羥基的二元醇結(jié)構(gòu),其生物合成過程可能是由P450加氧酶參與完成的。在擬南芥()中,MAH1作為羥化酶參與了二醇的合成[23]。田菁葉中二醇物質(zhì)的發(fā)現(xiàn),為今后研究二醇生物合成途徑提供了新的材料。

圖8 竹豆莖和葉蠟質(zhì)各組分同系物相對含量

3種豆科綠肥作物莖和葉中蠟質(zhì)含量存在較大差異, 其中莖蠟質(zhì)含量最高的是檉麻, 其次是田菁, 竹豆蠟質(zhì)含量最低。一般情況下, 植物蠟質(zhì)含量的增加與其抗旱性的提高相聯(lián)系[2]。盡管都是夏季綠肥作物, 蠟質(zhì)含量較低的竹豆為藤本植物, 群體高度低、葉片數(shù)量多、地表覆蓋度高, 在進化過程中其生長環(huán)境可能相對濕潤, 不需要過高的蠟質(zhì)沉積就能適應(yīng)生長環(huán)境。而檉麻與田菁株型直立, 地表覆蓋度低, 生長環(huán)境相對干燥, 葉片可能需要沉積較多的蠟質(zhì)來抵御逆境脅迫。當(dāng)然, 影響植物抗逆性的因素較多, 今后有必要進一步分析幾種植物蠟質(zhì)含量與其抗旱性的關(guān)系。就莖和葉角質(zhì)層蠟質(zhì)含量比較, 擬南芥莖稈高于葉片[24], 馬鈴薯()無顯著差異[25], 蒲公英()葉片高于莖稈[26], 本試驗中檉麻莖高于葉片, 而田菁和竹豆莖和葉蠟質(zhì)無顯著差異。這些結(jié)果說明不同植物莖和葉角質(zhì)層蠟質(zhì)的沉積存在器官特異性, 且這可能與各自不同的生理功能有關(guān)。對12個大麥品種的比較發(fā)現(xiàn), 蠟質(zhì)沉積較多的品種具有較高的抗旱性[3]。轉(zhuǎn)錄因子MYB96在亞麻薺()中的超量表達(dá)可顯著增加蠟質(zhì)沉積, 并提高植物抗旱性[27]。

在莖和葉蠟質(zhì)組分方面, 檉麻莖以烷烴為優(yōu)勢組分, 而葉以初級醇為優(yōu)勢組分, 說明參與蠟質(zhì)合成的主效基因在2個器官的表達(dá)存在差異, 如擬南芥參與初級醇合成的CER4在葉中較高表達(dá), 而參與烷合成的CER1在莖中高表達(dá)[28]。田菁莖和葉中的優(yōu)勢組分均為初級醇(30.12%和71.21%), 且烷烴組分比例不足10%, 說明田菁角質(zhì)層蠟質(zhì)以醇合成途徑為主。竹豆莖和葉中的優(yōu)勢成分均為烷烴, 說明其角質(zhì)層蠟質(zhì)合成以烷合成途徑為主。在其他作物上也有類似的研究結(jié)果, 如紫花苜蓿葉以初級醇為主, 莖以烷為主[14]; 亞麻薺()葉以烷基酯為主, 莖以三萜類化合物為主[29]; 而玉米葉以初級醇為主, 莖以醛為主[30]。盡管目前尚無法確定這些優(yōu)勢組分是否在植物抗逆方面起主要作用, 然而干旱脅迫下烷類含量的增加被認(rèn)為與多數(shù)植物的抗旱性提高有關(guān)[2]; 植物葉表長鏈醛類的缺失可抑制病原真菌孢子的萌發(fā)[31]。

3種綠肥作物莖和葉中主要的蠟質(zhì)組分均以同系物形式存在, 且整體表現(xiàn)出脂肪酸、初級醇和醛以偶數(shù)碳占優(yōu)勢、而烷烴以奇數(shù)碳占優(yōu)勢的碳鏈分布特征。這與絕大多數(shù)植物上的研究結(jié)果是一致的[32]。就蠟質(zhì)組分內(nèi)同系物優(yōu)勢化合物碳鏈長度分析, 檉麻和竹豆莖和葉均以C31為優(yōu)勢化合物, 而田菁以C29為優(yōu)勢化合物。說明參與烷烴生物合成的同源基因在莖和葉中是一致的。莖和葉初級醇優(yōu)勢化合物在檉麻和田菁是一致的, 分別為C28和C30; 而竹豆莖中以C28為優(yōu)勢化合物, 葉中以C32為優(yōu)勢化合物。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能在于鏈長延長酶(FAE)及參與初級醇合成的CER4在竹豆不同器官存在差異[33]。醛被認(rèn)為是烷合成途徑和醇合成途徑的中間產(chǎn)物[9]。幾種綠肥作物莖和葉中醛的優(yōu)勢化合物存在較大差異, 暗示不同器官的醛可能來自不同的合成途徑。

4 結(jié)論

從3種夏季綠肥作物莖和葉中共鑒定出8類化合物, 包括脂肪酸、初級醇、烷基酯、醛類、烷烴、二醇、萜類和固醇類化合物。盡管主要蠟質(zhì)組分在品種及部位間一致, 但不同作物及部位又有各自獨特的組分存在, 如檉麻莖中未檢測出脂肪酸, 田菁莖中鑒定出固醇類和二醇化合物。其中田菁莖中的二醇化合物初步結(jié)構(gòu)解析為1,18-30烷醇和1,16-30烷醇。此外, 不同物種、不同部位所積累的優(yōu)勢組分及優(yōu)勢化合物也存在一定差異, 說明參與蠟質(zhì)合成的基因在物種、器官間有所不同。這為今后從分子水平上揭示角質(zhì)層蠟質(zhì)參與夏季綠肥作物抗逆機制提供了理論基礎(chǔ)。

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Chemical compositions of cuticular waxes on stems and leaves of three legume green manure crops

LI Yang, YAO Lu-Hua, GUO Xin, ZHAO Xiao, HUANG Lei, WANG Deng-Ke, ZHANG Xue-Feng, XIAO Qian-Lin, YANG Rui-Ji, and GUO Yan-Jun*

College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400716, China

Cuticular waxes are hydrophobic compounds covering plant surfaces and play vital roles in protecting plants from various biotic and abiotic stresses. However, less is known as related to the cuticular wax on leaves or stems of summer legume green manures. In the current study, stems and leaves from three summer legume green manure crops grown in the fields were sampled, including,, andRoxbwere.Using gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS), we identified most of the chemical compounds on these plant species. In total, eight classes of wax compounds were identified, including fatty acids, primary alcohols, aldehydes, alkanes, alkyl esters, diols, terpenoids and sterols. Among these compounds, fatty acids, primary alcohols, aldehydes and alkanes with serial homologs could be observed in stems and leaves of all tested plant species excepting fatty acids in leaves of, with their weight proportions accounting for more than 60% in total wax. This suggested that alkane forming and alcohol forming pathways were two major biosynthesis pathways in these plants. In stems of, two compounds were identified as diols with the functional hydroxyl group located at 1,18 and 1,16 positions. Using gas chromatography with flam ionized detector (GC/FID), we quantified the total wax and wax compounds. Total wax coverage differed among three plant species and between two organs. The total stem wax coverage was the highest in(16.33 μg cm–2), followed by(6.45 μg cm–2) and(0.72 μg cm–2). The total wax coverage on stems ofwas significantly higher than that on leaves, whereas no significant difference in total wax coverage between stems and leaves was observed inand. The predominant wax class differed in plant species and organs. Foralkanes were the predominant composition in stems accounting for 57.38% of total wax, whereas primary alcohols were the predominant composition in leaves accounting for 50.12%. For, both stems and leaves were dominated by primary alcohols, accounting for 30.12% and 71.21% of total wax, respectively. For, both stems and leaves were dominated by alkanes, accounting for 40.79% and 39.27% of total wax, respectively. We further analyzed the chain length distributions of the wax classes in stems and leaves. Generally, fatty acids, primary alcohols and aldehydes were consisted of serials of even carbon number homologs, whereas alkanes were consisted of both even- and odd-carbon number homologs with odd number predominance over even number. The predominant compound in each wax class also differed between plant species and organs. The dominant fatty acids on stems and leaves in,, andwere C30, C30and C26, and C28, respectively; the dominant primary alcohols were C28, C30, and C28and C32respectively; the dominant aldehydes were C32and C30, C30, and C30and C28, respectively; while the dominant alkanes were C31, C29, and C31, respectively. The terpenoids identified in current study were β-amyrin,a-amyrin and lupenol. The variations of predominant wax class and wax compound between plant species and organs implied that genes involved in wax biosynthesis might also be different. These results provide basic knowledges in studying the molecular mechanisms of cuticular waxes in legume green manure crops fronting biotic and abiotic stresses.

Cuticular wax; green manures;;;

2019-03-24;

2019-05-12;

2019-07-22.

10.3724/SP.J.1006.2020.94048

郭彥軍, E-mail: qhgyj@126.com

E-mail: 286923599@qq.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31670407)和中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(XDJK2018B021)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31670407) and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2018B021).

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190719.1721.008.html