孫程明 陳 鋒 陳 松 彭 琦 張 維 易 斌張潔夫,* 傅廷棟

研究簡報

甘藍型油菜每角粒數的全基因組關聯分析

孫程明1,2陳 鋒1陳 松1彭 琦1張 維1易 斌2,*張潔夫1,*傅廷棟2

1江蘇省農業(yè)科學院經濟作物研究所 / 農業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室 / 江蘇省現代作物生產協同創(chuàng)新中心, 江蘇南京210014;2華中農業(yè)大學植物科學技術學院 / 作物遺傳改良國家重點實驗室, 湖北武漢 430070

每角粒數是油菜重要的產量構成因子, 增加每角粒數有助于提高油菜的籽粒產量。利用Illumina 60K SNP芯片對496份具有代表性的油菜資源進行基因型分析, 考察該群體在2個環(huán)境中的每角粒數, 利用MLM和GLM模型進行全基因組關聯分析。結果表明, 本群體在2個環(huán)境中每角粒數的廣義遺傳力為57.7%。利用MLM和GLM模型分別檢測到9個和20個位點, 所有MLM位點均得到GLM結果的驗證。6個位點與前人定位的QTL重疊, 其中2個位點得到2次驗證, 其余14個是新位點。在7個位點附近找到了候選基因, 其中在C09染色體的位點Bn-scaff_15576_1-p74980附近找到已克隆的油菜每角粒數基因, 在其余6個位點附近找到、等已知的擬南芥每角粒數基因的同源基因。本研究結果有助于解析油菜每角粒數的遺傳基礎及其調控機制, 為每角粒數的遺傳改良奠定了基礎。

甘藍型油菜; 產量; 每角粒數; 關聯分析; SNP標記

油菜是我國重要的油料作物, 種植面積約690萬公頃,產油量占國產植物油總量的55%以上, 是我國最大的食用植物油來源[1]。作為食用油消費大國, 我國食用油60%以上卻依賴進口, 油菜的產量水平直接影響我國食用油的供給, 因此, 提高產量成為油菜育種最迫切的目標。每角粒數是油菜重要的產量構成因子, 解析其遺傳基礎對提高油菜產量具有重要意義。

油菜種子的形成起始于胚珠原基, 而胚珠原基需要經歷珠被、珠心和胚囊的形成, 以及授粉、受精、種子發(fā)育等過程才能最終形成種子, 這一系列過程受到復雜的遺傳網絡調控。李永鵬等[2]研究表明, 部分胚珠原基在發(fā)育過程中敗育而最終不能形成成熟的種子, 正常發(fā)育胚珠百分比是反映品種間每角粒數差異的重要因素。Yang等[3]進一步研究表明, 油菜每角粒數的自然變異由每子房胚珠數(30.7%)、可育胚珠比(18.2%)、可育胚珠授精率(7.1%)和授精胚珠發(fā)育成種子的比率(43.9%)的差異共同決定。

多位研究者采用連鎖分析定位了每角粒數QTL, Shi等[4]利用TN DH及F2群體在13條染色體檢測到69個每角粒數QTL, 解釋的表型變異范圍是3.2%~15.5%; Luo等[5]利用60K SNP芯片再次對TN DH群體進行QTL定位, 共檢測到64個每角粒數QTL, 其中貢獻率最大的2個QTL和均位于A01染色體, 分別解釋20.4%和24.1%的表型變異; 漆麗萍[6]在A01、A06~A08、C01、C03和C05染色體檢測到15個QTL, 其中貢獻率最大的2個QTL和均位于A01染色體, 分別解釋26.3%和26.6%的表型變異; Cai等[7]在A01~A04、A06、A08~A10、C01、C03、C05、C06和C08染色體檢測到17個QTL, 可解釋5.6%~26.4%的表型變異; Yang等[8]利用一個RIL群體在A02、A06、C01、C04和C06染色體檢測到5個QTL, 可解釋5.3%~24.8%的表型變異, 其中位于A06的QTL在多個環(huán)境中被重復檢測到, 解釋20.1%的表型變異。

近年來, 隨著高密度SNP基因分型芯片和全基因組測序等技術的發(fā)展, 全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)已廣泛應用于油菜復雜性狀的遺傳結構解析[9-12]。本研究以496份具有代表性的油菜資源為關聯群體, 利用60K SNP芯片對群體進行基因型分析, 并對每角粒數進行全基因組關聯分析, 旨在挖掘顯著的SNP位點, 分析其候選基因, 為油菜每角粒數的遺傳改良奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

用于關聯分析的496份甘藍型油菜包括國內外的地方品種、育成品種及高世代育種材料(附表1)。其中國內資源444份, 主要來自湖北、重慶、江蘇、湖南、四川、陜西等油菜主產省市; 國外資源52份, 主要來自德國、瑞典、朝鮮、加拿大等國家。所有材料均由華中農業(yè)大學國家油菜工程技術研究中心提供。

1.2 田間試驗與表型調查

于2015年和2016年在江蘇泰州(15TZ和16TZ)種植自然群體。采用完全隨機區(qū)組設計, 設置2個重復, 單個材料每重復種2行, 每行15株, 行寬1.5 m, 行距40 cm。每年10月上旬大田直播, 田間管理按當地常規(guī)方式進行。在油菜成熟期, 取每小區(qū)8株長勢一致的植株, 選主花序中部10個角果測量每角粒數。利用R軟件對各環(huán)境的每角粒數表型進行統(tǒng)計分析和相關性分析, 并計算廣義遺傳力和最佳線性無偏預測值(best linear unbiased prediction, BLUP)[13-14]。

1.3 基因型檢測與分析

利用Illumina 60K SNP芯片對496份甘藍型油菜資源進行基因型分析。在Genome Studio軟件中, 剔除Call Freq參數 < 0.75, 稀有等位基因頻率 < 0.05, AA、BB頻率 < 0.03及GenTrain值 < 0.50的SNP, 基因型雜合的SNP按缺失值處理。將過濾后的33,218個SNP序列比對至油菜Darmor-基因組, e-value閾值設為10-12, 保留19,167個單拷貝、位置清楚的SNP標記用于后續(xù)分析。

1.4 全基因組關聯分析

用Structure 2.3.3進行群體結構Q矩陣的計算[15], 用SPAGeDi計算材料間的親緣關系K矩陣[16]。將基因型、表型、Q矩陣和K矩陣導入Tassel 4.0后, 以Q矩陣和Q+K矩陣作協變量, 分別進行基于一般線性模型(General Linear Model, GLM)和混合線性模型(Mixed Linear Model, MLM)的全基因組關聯分析[17]。參考前人文獻[9-12], 關聯分析的顯著性閾值 (Bonferroni threshold) 定為1/總標記數, 即-lg() = 4.28。當1 Mb區(qū)間內存在多個顯著SNP時, 如果兩兩間的2≥0.1, 則將這些SNP歸為一個關聯位點, 以最小值的SNP作為代表。用R軟件包qqman繪制曼哈頓圖和QQ (Quantile- Quantile)圖[18]。

1.5 候選基因挖掘

以2= 0.1作為衰減閾值, 用Tassel計算顯著關聯位點的LD衰減距離作為其置信區(qū)間, 提取置信區(qū)間內的基因CDS序列, 與擬南芥的基因CDS進行BLAST比對, 設e-value閾值為10-10, 以相似度最高的擬南芥基因信息來注釋油菜基因。將落在置信區(qū)間的油菜每角粒數基因和擬南芥每角粒數基因的同源基因作為候選基因。

2 結果與分析

2.1 每角粒數表型分析

496份油菜資源的每角粒數在2個環(huán)境中具有廣泛的變異, 單個環(huán)境的每角粒數極差范圍是15.24~18.90。單個環(huán)境表型平均值范圍是(20.56±1.99)~(21.45±2.36), 變異系數范圍是0.10~0.11 (表1和圖1)。2個環(huán)境間的相關系數為0.55 (≤ 0.001), 達到極顯著水平, 這表明本研究考察的表型數據具有較高的可靠性和重復性。每角粒數在2個環(huán)境的廣義遺傳力為57.7%。

2.2 每角粒數全基因組關聯分析

利用MLM模型對各環(huán)境的每角粒數表型和BLUP值進行全基因組關聯分析, 當閾值為?lg() = 4.28時, 在15TZ、16TZ和基于BLUP分別檢測到6、2和2個顯著位點(表2和圖2)。位于C02的位點Bn-scaff_15712_6- p1336179在15TZ和16TZ兩環(huán)境中被重復檢測到。合并重疊的位點后得到9個顯著位點, 分布在A01、A04、A07、A08、C01~C04染色體, 可解釋3.26%~4.61%的表型變異。

表1 關聯群體每角粒數性狀的統(tǒng)計分析

圖1 關聯群體在2個環(huán)境的每角粒數分布

圖2 油菜每角粒數全基因組關聯分析(MLM)

A: 每角粒數BLUP值MLM曼哈頓圖; B: 15TZ每角粒數MLM曼哈頓圖; C: 16TZ每角粒數MLM曼哈頓圖。水平線代表Bonferroni閾值。

A: Manhattan plot of MLM based on BLUP value; B: Manhattan plot of MLM in15TZ; C: Manhattan plot of MLM in 16TZ. The dashed horizontal line depicts the Bonferroni significance threshold.

表2 MLM每角粒數顯著關聯位點

利用GLM模型對各環(huán)境的每角粒數表型和BLUP值進行全基因組關聯分析, 當閾值為?lg() = 4.28時, 在15TZ、16TZ和基于BLUP分別檢測到10、6和5個顯著位點。位于C04的位點Bn-scaff_23907_1-p3780基于BLUP和在15TZ均被重復檢測到, 合并重疊的位點后得到20個顯著位點, 分布在A01、A04、A07、A08、C01~C07和C09染色體, 可解釋2.90%~4.83%的表型變異(表3和圖3)。比較2個關聯模型的結果, 所有MLM位點均得到GLM結果的驗證, 合并2個模型的結果共得到20個顯著位點。

圖3 油菜每角粒數全基因組關聯分析(GLM)

A: 每角粒數BLUP值GLM曼哈頓圖; B: 15TZ每角粒數GLM曼哈頓圖; C: 16TZ每角粒數GLM曼哈頓圖。水平線代表Bonferroni閾值。

A: Manhattan plot of GLM based on BLUP value; B: Manhattan plot of GLM in 15TZ; C: Manhattan plot of GLM in 16TZ. The dashed horizontal line depicts the Bonferroni significance threshold.

表3 GLM每角粒數顯著關聯位點

2.3 候選基因挖掘

基于油菜基因組注釋信息, 在C09染色體Bn-scaff_ 15576_1-p74980位點下游82 kb找到已克隆的油菜每角粒數基因, 該基因是擬南芥的同源基因(表4)。參與調控油菜大孢子母細胞的減數分裂, 該基因的自然缺失導致部分雌配子體發(fā)育異常, 無法形成正常功能的胚珠, 最終導致油菜每角果粒數顯著降低[19]。此外, 在A04染色體Bn-A04-p10393460位點上游522 kb找到候選基因, 該基因的擬南芥同源基因編碼一個短富含甘氨酸結構域的蛋白, 該基因突變導致植株角果長度縮短、每角粒數減少、粒重降低[20]。在C03染色體Bn-scaff_23954_1-p635109位點下游162 kb找到候選基因, 該基因的擬南芥同源基因編碼一個E3泛素連接酶, 其功能缺失突變體每角粒數增加、粒重增加[21]。此外, 本研究還找到其他候選基因, 包括擬南芥已知每角粒數調控基因[22]、[23][24]和[25]在油菜中的同源拷貝。

3 討論

每角粒數是油菜重要的產量構成因子, 增加每角粒數有利于提高單株籽粒產量, 從而提高群體的籽粒總量。本研究對496份油菜資源的每角粒數進行2個環(huán)境的考察, 分析表明本群體的每角粒數廣義遺傳力為57.7%。利用2個關聯模型MLM和GLM, 檢測到20個顯著位點, 分布于12條染色體。本研究中每角粒數關聯位點的效應較小(< 5%), 在2個環(huán)境間能被重復檢測到的位點少, 表明該群體中每角粒數主要受微效多基因調控, 且基因效應受環(huán)境影響較大。

本研究獲得的每角粒數QTL有6個位點與前人結果一致(表2和表3), 其中位于C01染色體的位點Bn-scaff_15936_1-p270915, 物理位置36.41 Mb, 與Luo等[5]檢測到的每角粒數QTL(范圍: 36.53~37.48 Mb)和漆麗萍[6]檢測到的QTL(范圍: 35.69~36.81 Mb)重疊。位于C09染色體的位點Bn-scaff_15576_ 1-p74980物理位置是41.13 Mb, 與Li等[19]已克隆的每角粒數基因(位置: 41.21 Mb)和Luo等[5]檢測到的QTL(范圍: 41.28~41.67 Mb)重疊。這些結果證實了本研究結果的可靠性。此外, 本研究還檢測到14個新位點, 如位于A04染色體的Bn-A04-p10393460和C04染色體的Bn-scaff_23907_1-p3780, 表型貢獻率均相對較高; 位于C02染色體的位點Bn-scaff_15712_6- p1336179在2個環(huán)境中被重復檢測到, 這些位點值得進一步驗證和研究。

目前油菜中已報道的每角粒數基因較少, Li等[19]利用圖位克隆的方法, 在C09染色體克隆了每角粒數基因; Yang等[26]應用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除在油菜A04和C04染色體的2個拷貝, 雙突變植株葉片增多, 每角粒數和粒重均增加; Shah等[27]發(fā)現擬南芥在油菜A02染色體的拷貝突變, 導致了油菜株高、分枝高度、分枝數、每角粒數和單株產量等性狀的改變。本研究在Bn-scaff_15576_1-p74980位點下游82 kb找到(表4)。此外, 還在另外6個位點附近找到了候選基因, 這些基因的擬南芥同源基因均參與每角粒數的調控, 部分基因還有一因多效的作用, 如[20]和[22]同時影響角果長、粒型和粒重等性狀。后續(xù)研究可通過轉基因或CRISPR/Cas9敲除, 進一步驗證這些候選基因的功能。

表4 每角粒數關聯位點候選基因信息

附表 請見網絡版: 1) 本刊網站http://zwxb. chinacrops.org/; 2) 中國知網http://www.cnki.net/; 3) 萬方數據http://c.wanfangdata.com.cn/Periodical-zuowxb.aspx。

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Genome-wide association study of seed number per silique in rapeseed (L.)

SUN Cheng-Ming1,2, CHEN Feng1, CHEN Song1, PENG Qi1, ZHANG Wei1, YI Bin2,*, ZHANG Jie-Fu1,*, and FU Ting-Dong2

1Institute of Industrial Crops, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Cotton and Rapeseed (Nanjing), Ministry of Agriculture / Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Crop Production, Nanjing 210014, Jiangsu, China;2National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement / College of Plant Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, Hubei, China

Seed number per silique (SSN) is a key component of seed yield in rapeseed, increasing SSN can improve the seed yield of plants. A collection of 496 representative rapeseed accessions was genotyped by the Illumina 60K SNP array and phenotyped for SSN in two environments. The genome-wide association study (GWAS) of SSN was performed via the MLM (Mixed linear model) and GLM (General linear model). The broad-sense heritability of SSN was 57.7%. Nine and twenty loci were detected with MLM and GLM, respectively, and all loci detected by MLM were included those by GLM. Six loci were overlapped with reported QTLs, and two of them were validated by two independent researches, and the rest 14 loci were new. We identified plausible candidate genes nearby seven loci, and the reported rapeseed SSN genewas found near the locus Bn-scaff_15576_1-p74980 on C09 chromosome detected in this study. Besides, six candidates orthologous to documentedSSN genes, like,,,and, were found near our GWAS loci. The results provide an insight into the genetic basis of seed number per silique and lay a foundation for further mechanism exploration and breeding for this trait in.

L.; yield; seed number per silique; GWAS; SNP

2019-04-15;

2019-08-09;

2019-09-11.

10.3724/SP.J.1006.2020.94060

本研究由國家重點研發(fā)計劃項目(2018YFD0100602), 國家現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項(CARS-12), 江蘇省農業(yè)科技自主創(chuàng)新基金(CX(19)3055), 江蘇省基礎研究計劃(自然科學基金)項目(BK20190260)和中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金資助項(2662016PY063)資助。

The study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2018YFD0100602), the Earmarked Fund for China Agriculture Research System (CARS-12), the Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund (CX(19)3055), the Natural Fund Project of Jiangsu Basic Research Program (BK20190260), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (2662016PY063).

張潔夫, E-mail: jiefu_z@163.com; 易斌, E-mail:yibin@mail.hzau.edu.cn

E-mail: suncm8331537@gmail.com

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190910.1542.018.htm