吳雍真，李 倩，管連城，李 文，高 潔，陳云志，朱 星，柴藝匯*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽 550025) 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院(貴州 貴陽 550002)

急性腎損傷(Acute Kidney Injury,AKI)是指由于各種因素導(dǎo)致腎功能短期內(nèi)急劇下降致使機(jī)體內(nèi)代謝產(chǎn)物潴留，水、電解質(zhì)、酸堿平衡紊亂的臨床綜合征[1]。近年來，AKI的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。據(jù)調(diào)查顯示[2]，重癥監(jiān)護(hù)室中成年AKI發(fā)病率在16%～67%之間，并且AKI一旦發(fā)生，其病死率高達(dá)50%以上。目前，隨著醫(yī)藥產(chǎn)品的迅猛發(fā)展，臨床上不斷出現(xiàn)新藥，藥物誘導(dǎo)AKI已呈上升趨勢(shì)，在重癥AKI患者中，超過20%是藥物性損害[3]。藥物因素已成為AKI發(fā)病的重要病因，其中聯(lián)合使用或大劑量使用抗生素所致AKI問題最為突出，以慶大霉素為代表的氨基糖苷類抗生素是所有抗生素中最易導(dǎo)致腎損傷的一類藥物，其腎毒性的發(fā)生率高達(dá)11%～26%[4]。因此，緩解藥源性AKI是目前亟待解決的問題。

研究表明[5]，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase,MAPK)家族成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、p38MAPK與腎臟疾病關(guān)系密切，并且p38MAPK可能參與慶大霉素?fù)p傷腎臟的過程。眾多研究均發(fā)現(xiàn)抑制ERK1/2、p38MAPK激活可緩解藥物導(dǎo)致的腎損傷。而作為類固醇激素的維生素D(Vitamin D，VD)則具有保護(hù)腎臟的作用。研究發(fā)現(xiàn)[6]，VD可通過作用于腎小管上皮細(xì)胞、抑制炎癥細(xì)胞因子如巨噬細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等起腎臟保護(hù)作用，其也可調(diào)節(jié)ERK1/2、p38MAPK發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗炎活性的作用[7]。黃芪多糖(APS)為中藥黃芪的主要活性成分。臨床研究發(fā)現(xiàn)，APS可改善腎臟病變患者腎功能，有效保護(hù)糖尿病腎病及腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎臟[8]。目前APS治療腎臟病變相關(guān)疾病臨床有效但具體機(jī)制尚不明確。本研究擬采用腹腔注射慶大霉素建立AKI豚鼠模型，觀察APS對(duì)ERK1/2、p38MAPK及VD的影響，探討APS改善慶大霉素誘導(dǎo)AKI的作用機(jī)制，為臨床尋找有效防治藥物提供理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物成年健康豚鼠32只，雌雄各半，體質(zhì)量(275±25)g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK (湘) 2014-0010。

1.2藥品與試劑慶大霉素(開封制藥集團(tuán)有限公司，批號(hào)18012201)；APS(合肥中龍神力動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)20170916)；骨化三醇(青島正大海爾制藥有限公司，批號(hào)1709251)；25(OH)D3ELISA試劑盒(批號(hào)201901)購(gòu)自上海泛柯實(shí)業(yè)有限公司；肌酐(Cr)ELISA試劑盒(批號(hào)20190108)、尿素氮(BUN)ELISA試劑盒(批號(hào)20190107)、iNOS ELISA試劑盒(批號(hào)20181228)、MCP-1 ELISA試劑盒(批號(hào)20190710)均購(gòu)自南京建成有限公司；Trizol總RNA提取試劑(Aidlab公司，Lot252250AX)；HiScript Reverse Transcriptase(VAZYME公司，批號(hào)R101-01/02)；Ribonuclease Inhibitor(TRANS公司，LotJ11202)；兔多抗GAPDH(杭州賢至生物有限公司，批號(hào)AB-P-R 001)；兔多抗VDR(Abcam公司，批號(hào)Ab3508)；兔單抗CYP27B1(Abcam公司，批號(hào)Ab206655);山羊多抗CYP24A1(NovUS公司，批號(hào)NBP1-52111);兔單抗p-p38MAPK(Cell Signaling Technology公司，批號(hào)4511)；兔單抗P-ERK(Cell Signaling Technology公司，批號(hào)4370)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(批號(hào)BA1054)、HRP標(biāo)記兔抗羊二抗(批號(hào)BA1060)、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗(批號(hào)BA1051)，武漢博士德生物工程有限公司。BX53型生物顯微鏡(奧林巴斯公司)、RM2016 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó) Leica)、MK-3酶標(biāo)儀 (Thermo公司)；QuantStudio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 (ABI公司)；Nano-100微量分光光度計(jì)(杭州奧盛儀器有限公司)；蛋白印跡電泳系統(tǒng)(北京六一儀器廠)。

1.3方法

1.3.1 動(dòng)物分組與實(shí)驗(yàn)方案 豚鼠32只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為4組，每組8只，分為正常對(duì)照組、模型組、APS組、VD組。正常對(duì)照組每天給予腹腔注射生理鹽水100 mL/d；模型組，給予腹腔注射硫酸慶大霉素注射液，80 mg/(kg·d-1)，連續(xù)21 d；APS組灌胃APS 200 mg/kg，1次/d，1 h后腹腔注射慶大霉素，劑量同模型組，連續(xù)使用21 d；VD組灌胃骨化三醇30 ng/kg，1次/d，1 h后腹腔注射慶大霉素，劑量同模型組，連續(xù)使用21 d；每天對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行稱重，以調(diào)整藥物用量。

1.3.2 樣本采集 最后一次給藥后，禁食禁水24 h，麻醉豚鼠，右心室取血，離心收集血清后置-80℃冰箱凍存。摘取腎臟，部分-80℃保存，部分4%多聚甲醛固定常溫保存。

1.3.3 HE染色觀察腎臟組織病理結(jié)構(gòu)變化 取腎組織4%多聚甲醛固定、乙醇梯度脫水、石蠟包埋、切片及蘇木素-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察正常對(duì)照組、模型組及給藥組之間腎臟病理學(xué)變化。

1.4 ELISA檢測(cè)豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平根據(jù)試劑盒說明書操作，在酶標(biāo)儀450nm處讀取吸光值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式，求得樣品濃度。

1.5 RT-PCR法檢測(cè)腎臟VDR、24-羥化酶(CYP24A1)mRNA、1α-羥化酶(CYP27B1)的表達(dá)

使用TRizol試劑提取腎臟總RNA，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。擴(kuò)增引物由武漢擎科生物科技有限公司合成，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：50 ℃預(yù)反應(yīng)2 min，95 ℃ 10 min，95℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，40次循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繪制溶解曲線，以2-△△Ct進(jìn)行分析樣本的相對(duì)定量值。

表1 引物序列表

1.6 Westernblot檢測(cè)腎臟CYP27B1、CYP24A1、p-p38MAPK、p-ERK1/2、VDR蛋白表達(dá)提取腎臟組織總蛋白，-20 ℃分裝保存。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白濃度和相應(yīng)的OD值計(jì)算直線回歸方程，求出樣品蛋白濃度。制膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，用含5% 脫脂奶粉的TBST室溫?fù)u床封閉2 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，清洗后加入二抗，37 ℃搖床孵育2 h，清洗多余二抗，ECL顯色，用BandScan分析膠片灰度值。

2 結(jié)果

2.1 APS對(duì)AKI豚鼠腎臟病理學(xué)改變的影響如圖1所示，正常對(duì)照組腎小管清晰可見上皮細(xì)胞刷狀內(nèi)緣，上皮細(xì)胞排列整齊，腎小球血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰。模型組腎小管上皮細(xì)胞刷狀內(nèi)緣全部消失，上皮細(xì)胞腫脹壞死，空泡變性，近曲小管管腔擴(kuò)張，不成形，腎小球血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)不清晰。APS組、VD組腎臟組織形態(tài)較模型組均有一定改善。

注：A：正常組；B：模型組；C：APS組；D：VD組圖1 APS對(duì)慶大霉素致AKI豚鼠腎臟病理變化的影響(×200)

2.2 APS對(duì)AKI豚鼠血清25(OH)D3、Cr、BUN、iNOS、MCP-1水平的影響與正常組比較，模型組豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量顯著升高(P<0.01)，血清25(OH)D3含量顯著下降(P<0.01)；與模型組比較，APS組及VD組均可顯著提高豚鼠血清25(OH)D3含量(P<0.01)，同時(shí)二者均可不同程度降低豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS含量(P<0.05)，見圖2。

表2 APS對(duì)慶大霉素致AKI豚鼠血清25(OH)D3，Cr，BUN，MCP-1和iNOS的影響

2.3 APS對(duì)AKI豚鼠腎臟VDR、CYP27B1、CYP24A1mRNA表達(dá)的影響與正常組比較，模型組豚鼠腎臟VDR、CYP27B1 mRNA表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，CYP24A1表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，APS組及VD組均可顯著提高豚鼠腎臟VDR mRNA表達(dá)量(P<0.01)、降低CYP24A1 mRNA表達(dá)量(P<0.01)；同時(shí)二者均可不同程度提高豚鼠腎臟CYP27B1 mRNA表達(dá)量，以APS組較為顯著(P<0.05)。見表3。

表3 APS對(duì)慶大霉素致AKI豚鼠腎臟VDR、CYP27B1、CYP24A1 mRNA表達(dá)的影響

2.4 APS對(duì)AKI豚鼠腎臟VDR、CYP27B1、CYP24A1、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響與正常組比較，模型組豚鼠腎臟VDR、CYP27B1 蛋白表達(dá)量顯著下降(P<0.01)，CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，APS組及VD組均可顯著提高豚鼠腎臟VDR 、CYP27B1蛋白表達(dá)量(P<0.01)，同時(shí)二者均可不同程度降低CYP24A1、p-P38MAPK、p-ERK1/2蛋白表達(dá)量(P<0.05)，APS組對(duì)CYP24A1、p-P38MAPK蛋白作用更為顯著(P<0.01)，VD組對(duì)p-ERK1/2蛋白作用更為顯著(P<0.01)。見表4，圖2。

圖2 各組豚鼠VDR、CYP27B1、CYP24A1、p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)情況

表4 APS對(duì)慶大霉素致AKI豚鼠腎臟VDR、CYP27B1、CYP24A1、p-p38MAPK和p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

3 討論

慶大霉素為抗菌譜廣、療效可靠、價(jià)格低廉且臨床應(yīng)用廣泛的抗生素，但因具有腎臟毒性，嚴(yán)重限制其使用范圍。雖慶大霉素引起腎毒性早已明確，但其具體的產(chǎn)生機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。慶大霉素對(duì)腎臟的毒性作用主要表現(xiàn)為近端腎小管損害，繼而導(dǎo)致腎小球?yàn)V過功能失常、腎小管上皮細(xì)胞壞死等[9]。研究發(fā)現(xiàn)[10]炎癥反應(yīng)可能是慶大霉素致AKI的重要因素，慶大霉素可增加炎癥因子的分泌，促使白細(xì)胞浸潤(rùn)和影響MCP-1的表達(dá)，引起功能和結(jié)構(gòu)損傷。此外，iNOS為體內(nèi)重要的促炎性酶，被激活可產(chǎn)生大量的NO破壞腎臟細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，APS與VD均具有降低AKI豚鼠血清Cr、BUN、MCP-1、iNOS水平并減輕腎臟結(jié)構(gòu)損傷的作用，說明APS與VD能夠通過減輕炎癥、抑制大量NO的生成，對(duì)腎臟細(xì)胞的破壞保護(hù)慶大霉素誘導(dǎo)的AKI。

MAPK是一組細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。研究顯示[9]，MAPK 信號(hào)途徑參與多種細(xì)胞生理過程，如：增殖、分化、凋亡及炎癥反應(yīng)等，與眾多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。p38MAPK是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，可被細(xì)胞因子與氧化應(yīng)激激活，使致炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)上調(diào)。研究也發(fā)現(xiàn)，p38MAPK與慶大霉素、順鉑等具有腎臟毒性藥物引起的AKI關(guān)系密切。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在慶大霉素致AKI的過程中p-p38MAPK的表達(dá)水平上升，且使用藥物通過抑制p38MAPK與核轉(zhuǎn)錄因子kappaB的表達(dá)可改善慶大霉素引起的腎損傷[11]。ERK1/2信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中起重要作用，ERK的磷酸化級(jí)聯(lián)過程調(diào)節(jié)多種炎癥蛋白基因的表達(dá)。通過抑制ERK1/2信號(hào)通路可保護(hù)H2O2與順鉑導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，并且p-ERK1/2表達(dá)水平在缺血再灌注與脂多糖致急性腎損傷后出現(xiàn)迅速升高[12]。本研究顯示，APS組與VD組均可下調(diào)慶大霉素致AKI豚鼠p-p38MAPK、p-ERK1/2的表達(dá)水平，提示APS與VD對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)豚鼠腎損傷的保護(hù)作用與調(diào)節(jié)p38MAPK、ERK1/2信號(hào)通路有關(guān)。

研究表明VD為脂溶性物質(zhì)，是存在于人體的一種類固醇類激素，VD前體在肝臟經(jīng)27-羥化酶羥基化后轉(zhuǎn)化為25(OH)D3，再經(jīng)腎臟CYP27B1作用轉(zhuǎn)化為1，25(OH)2D3并與VDR結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，CYP24A1為VD限速酶，可使循環(huán)中各種形式的VD滅活[13]。雖然VD的活性成分是1，25(OH)2D3，但目前研究認(rèn)為25(OH)D3更能準(zhǔn)確反應(yīng)體內(nèi)VD水平，是評(píng)價(jià)機(jī)體VD的可靠指標(biāo)。近年來，諸多研究發(fā)現(xiàn)VD在各類腎臟疾病發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，可通過抗炎性反應(yīng)、抑制腎素-血管緊張素系統(tǒng)、改善腎小管與腎小球間質(zhì)纖維化等途徑達(dá)到對(duì)腎臟的保護(hù)作用[14]。離體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，1，25(OH)2D3可下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞MCP-1的轉(zhuǎn)錄。在體實(shí)驗(yàn)也顯示，利用VD類似物帕立骨化醇干預(yù)鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病模型小鼠后可抑制MCP-1的表達(dá)、降低MCP-1活性，從而改善腎小球硬化程度[15]。并且在AKI實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭?，選擇性VDR激動(dòng)劑已被證實(shí)對(duì)腎損傷具有保護(hù)作用[16]。此外，一項(xiàng)針對(duì)不同腎損害患者的研究顯示，患者尿MCP-1濃度和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)程度與1，25(OH)2D3成負(fù)相關(guān)，臨床觀察也發(fā)現(xiàn)AKI患者體內(nèi)VD水平較正常人明顯降低[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組血清25(OH)D3顯著降低，VDR、CYP27B1 mRNA與蛋白表達(dá)量顯著下降，CYP24A1 mRNA與蛋白表達(dá)量顯著升高，提示VD水平的降低與慶大霉素致AKI具有一定關(guān)系。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，APS具有免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝腎、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤等作用[18]。此外，APS不僅可通過調(diào)控p38MAPK信號(hào)通路，減輕缺氧復(fù)氧腎小管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)，還可通過調(diào)節(jié)Toll受體4/核轉(zhuǎn)錄因子kappaB信號(hào)通路，保護(hù)缺血再灌注導(dǎo)致的AKI[19]。前期研究也證實(shí)APS還可調(diào)節(jié)小鼠MC-3T3-E1成骨細(xì)胞VDR、CYP27B1、CYP24A1 mRNA及蛋白的表達(dá)[20]。

綜上所述， APS可調(diào)節(jié)慶大霉素誘導(dǎo)AKI豚鼠模型血清25(OH)D3、腎臟VDR、CYP27B1、CYP24A1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平。因此推測(cè)，APS可能是通過調(diào)節(jié)VD的表達(dá)而影響p38MAPK與ERK1/2信號(hào)通路以實(shí)現(xiàn)對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)AKI的保護(hù)作用，但其具體分子作用機(jī)制需后續(xù)進(jìn)一步研究。