鄺賢婷，譚 笑，陳思儀，劉淑霞，生書(shū)晶

（廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，廣東廣州 510225）

我國(guó)藥用植物資源種類(lèi)繁多，蘊(yùn)藏量豐富。隨著藥用植物藥理研究的深入，其應(yīng)用也越來(lái)越廣泛，日益受到世界醫(yī)療體系的認(rèn)可。近年來(lái)，藥用植物資源的社會(huì)需求不斷增加，但是多數(shù)藥用植物人工栽培生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖系數(shù)低，再加上藥用植物的藥效成分多為次生代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量低且易受環(huán)境氣候的影響，因此，很多藥用植物資源難以滿(mǎn)足社會(huì)需求。隨著生物學(xué)研究的發(fā)展，植物離體培養(yǎng)技術(shù)越來(lái)越成熟，以此來(lái)解決藥用植物的資源短缺問(wèn)題，無(wú)疑具有重要的社會(huì)價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。通過(guò)文獻(xiàn)查閱，結(jié)合筆者對(duì)何首烏等藥用植物的資源研究，概述了愈傷組織、細(xì)胞培養(yǎng)、不定根誘導(dǎo)以及毛狀根體系等植物離體培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用發(fā)面的研究。離體培養(yǎng)技術(shù)不但可以應(yīng)用于藥用植物的快速繁殖，還可以應(yīng)用于藥用植物有效成分的積累以及生物轉(zhuǎn)化合成新的化合物；通過(guò)離體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑進(jìn)行研究，可以從根源上提高次生代謝產(chǎn)物的含量，從而有助于緩解藥用植物的資源危機(jī)。

1 藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展

1.1 愈傷組織

愈傷組織是植物細(xì)胞脫分化后形成的一種無(wú)定形狀態(tài)的薄壁細(xì)胞，可以在短時(shí)間內(nèi)分化形成幼苗，實(shí)現(xiàn)快速繁殖，從而克服藥用植物人工栽培周期長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢的難題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)研究過(guò)的藥用植物超過(guò)400 種[1]。人參自古被稱(chēng)為“百草之王”，具有廣泛的藥理作用，早在20 世紀(jì)60年代，就已經(jīng)有了人參愈傷組織培養(yǎng)的報(bào)道[2]。但是由于人參愈傷組織生長(zhǎng)較為緩慢，且其中的有效成分含量遠(yuǎn)低于天然植株，至今人們還在探索和優(yōu)化人參愈傷誘導(dǎo)分化的條件，以便將其工業(yè)化生產(chǎn)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

植物細(xì)胞培養(yǎng)是指在細(xì)胞離開(kāi)生命體的前提下，以單個(gè)細(xì)胞體或者若干個(gè)細(xì)胞體為單位進(jìn)行懸浮培養(yǎng)[3]。植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可以?xún)?yōu)化最佳的培養(yǎng)條件，在較短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)，從而緩解藥用植物資源供應(yīng)的難題。從20 世紀(jì)80年代至今，藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)一直是研究的熱點(diǎn)，并取得一系列成果，如在人參、西洋參、紫草、紅豆杉的研究上均取得了細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的成功[4]。但是，由于植物細(xì)胞生長(zhǎng)相對(duì)較慢，次生代謝產(chǎn)物的合成與積累需要一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程容易受到培養(yǎng)條件如傳質(zhì)、傳氧等的影響，導(dǎo)致在多次傳代后出現(xiàn)老化的現(xiàn)象，因此，對(duì)優(yōu)質(zhì)懸浮細(xì)胞系進(jìn)行篩選和優(yōu)化仍是目前研究的重點(diǎn)[5-6]。另外，細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化的前提是合適的細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器的制備，如何解決在細(xì)胞生長(zhǎng)高黏度的狀態(tài)下，以合適的剪切力攪拌，達(dá)到傳質(zhì)、傳氧等最合適的植物細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，是植物細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化亟須解決的問(wèn)題。

1.3 不定根

不定根一般是在植物器官受傷或激素、病原微生物等外界因素刺激下由植物的莖或葉上長(zhǎng)出的根[7]。目前對(duì)藥用植物不定根的研究還不太廣泛，主要集中于幾種以根莖入藥的名貴藥用植物，如丹參、三七、人參、柴胡、白術(shù)等。但是人參不定根中皂苷含量低，仍然是亟待解決的問(wèn)題。其他藥用植物的不定根研究尚處于起步階段，如王梅等[7]通過(guò)向柴胡根離體培養(yǎng)體系中添加前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子等，探討了不同處理對(duì)柴胡不定根合成柴胡皂苷的影響，建立了北柴胡不定根生產(chǎn)柴胡皂苷的離體培養(yǎng)體系。陳巍等[8]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖濃度、培養(yǎng)基pH 值、接種量等外界培養(yǎng)條件顯著影響丹參不定根的生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物的合成。吳炯等[9]對(duì)白術(shù)試管苗不定根的誘導(dǎo)和離體培養(yǎng)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并且發(fā)現(xiàn)不定根中含有與藥用植物白術(shù)根莖中相同的各類(lèi)化學(xué)成分。

1.4 毛狀根

毛狀根又稱(chēng)發(fā)根，是發(fā)根農(nóng)桿菌侵染植株或某一器官組織而形成的。因毛狀根具有培養(yǎng)體系生長(zhǎng)迅速、效率高、遺傳性狀穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，已成為植物組織培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)。目前，已有100 多種植物的毛狀根被成功誘導(dǎo)[10]，通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基、光照、pH 值、溫度等物理因素以及添加外源激素、誘導(dǎo)子等化學(xué)因子，有些毛狀根中的次生代謝產(chǎn)物含量甚至?xí)^(guò)原植株含量，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。陳觀水等[11]建立了太子參毛狀根的培養(yǎng)體系，為利用毛狀根大規(guī)模生產(chǎn)藥用有效成分奠定了基礎(chǔ)。人參、三七、丹參、黃芪、當(dāng)歸、銀杏等藥用植物的毛狀根利用也已經(jīng)獲得成功[12]。其中，人參毛狀根已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了商業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，且其產(chǎn)品大規(guī)模應(yīng)用于制藥、食品和化妝品行業(yè)[13]。但是，大部分藥用植物毛狀根體系的研究仍處在研究階段，這是由于毛狀根經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)后會(huì)退化，其次生代謝產(chǎn)物的含量降低，因此，毛狀根體系的優(yōu)化和篩選仍然是目前研究的主要內(nèi)容。

2 藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用

2.1 藥用植物快速繁殖

由于人工栽培的藥用植物大多生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，而市場(chǎng)對(duì)名貴中藥材的需求日益增加，使得藥用植物資源過(guò)度開(kāi)發(fā)，一些珍惜藥用植物瀕臨滅絕。例如早些年我國(guó)蘊(yùn)藏量豐富的野生甘草已經(jīng)滅絕[14]。其他名貴中藥材如金花茶、人參和紅豆杉已被列入國(guó)家一級(jí)保護(hù)野生植物名錄，長(zhǎng)此以往，將對(duì)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)造成沖擊。利用離體培養(yǎng)技術(shù)分化成植株，可以實(shí)現(xiàn)藥用植物的快速繁殖，從而解決瀕危藥用植物的資源問(wèn)題。藏紅花引種我國(guó)以來(lái)，多采用分球繁殖的方式，繁殖系數(shù)低、種球易受病毒侵害且易退化，限制了藏紅花的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化種植[15]。針對(duì)該問(wèn)題，經(jīng)過(guò)多年的摸索，目前已經(jīng)建立了藏紅花花柱誘導(dǎo)愈傷組織的初代培養(yǎng)技術(shù)體系。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前已有200 多種藥用植物經(jīng)過(guò)離體培養(yǎng)成功獲得了試管植株，實(shí)現(xiàn)了快速繁殖，其中絕大多數(shù)為珍貴稀有的藥用植物[2]，如人參、鐵皮石斛、金線蓮等。

2.2 利用藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用植物活性化合物

藥用植物的活性產(chǎn)物往往是其次生代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低，利用離體培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥用植物活性成分具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近1 000 種藥用植物的離體培養(yǎng)技術(shù)獲得成功，提供了超過(guò)600 種的活性成分，并且人參、紫杉醇、青蒿素的離體培養(yǎng)生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到了工業(yè)化水平[1]。王娟等[16]綜述了藥用植物中次生代謝產(chǎn)物的積累，多種次生代謝產(chǎn)物如萜類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿、蒽醌類(lèi)、酚酸以及類(lèi)固醇等都通過(guò)不同的離體培養(yǎng)技術(shù)得到生產(chǎn)，如可以用烏拉爾甘草懸浮細(xì)胞來(lái)積累黃酮類(lèi)產(chǎn)物[17]、迷迭香懸浮細(xì)胞積累迷迭香酸[18]、雷公藤固定化離體細(xì)胞積累雷公藤甲素[19]、野葛細(xì)胞積累黃酮類(lèi)[20]、銀杏懸浮或者固定化細(xì)胞積累黃酮類(lèi)和銀杏內(nèi)酯等[21]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變培養(yǎng)條件，如調(diào)整培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分含量、調(diào)整pH 值和溫度、添加外源激素、進(jìn)行菌體感染等生物刺激，均能有效提高離體培養(yǎng)材料中活性成分的含量，這些研究為藥用植物中次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)提供了有效的途徑。

2.3 利用藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化合成

生物體系中會(huì)存在各種各樣的酶，而這些酶系統(tǒng)能夠?qū)ν庠葱缘孜镞M(jìn)行糖基化、羥基化、甲基化、氧化、還原等結(jié)構(gòu)修飾，即為生物轉(zhuǎn)化。由于多酶催化作用的不確定性，還可能產(chǎn)生一些新的活性物質(zhì)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今已有超過(guò)40 種的植物細(xì)胞成功進(jìn)行了生物轉(zhuǎn)化[22]，其中懸浮細(xì)胞和毛狀根體系應(yīng)用較多。LIU 等[23]使用長(zhǎng)春花懸浮細(xì)胞，將外源底物脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化成了13 個(gè)新的化合物。西洋參冠癭組織細(xì)胞在添加丹皮酚和大黃素后，可以合成多種糖基化、羥基化和甲基化的活性衍生物[24]。韓健等[25]利用長(zhǎng)春花及銀杏植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞分別成功地將青蒿素進(jìn)行轉(zhuǎn)化。由于懸浮培養(yǎng)細(xì)胞具有體細(xì)胞克隆不穩(wěn)定的缺陷，長(zhǎng)期生產(chǎn)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性降低，所以為了維持高產(chǎn)必須對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行不斷篩選。毛狀根轉(zhuǎn)化系統(tǒng)也已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物活性成分的生物轉(zhuǎn)化研究。目前已有人參、西洋參、何首烏、長(zhǎng)春花、紅景天、石斛等藥用植物進(jìn)行毛狀根生物轉(zhuǎn)化的報(bào)道，如人參毛狀根成功將毛地黃毒苷配基轉(zhuǎn)化成5 種酯化產(chǎn)物以及6 種糖苷化產(chǎn)物[26]，何首烏毛狀根體系可以轉(zhuǎn)化青蒿素類(lèi)、倍半萜類(lèi)、瑞香素等一系列化合物[20]。離體培養(yǎng)技術(shù)在生物轉(zhuǎn)化方面有著廣闊的發(fā)展前景，對(duì)于充實(shí)新化合物資源，甚至研制開(kāi)發(fā)新藥都是一個(gè)可行的方法，值得進(jìn)一步研究挖掘。

2.4 藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)在次生代謝工程方面的研究

藥用植物次生代謝工程是利用基因工程的手段對(duì)次生代謝途徑進(jìn)行修飾、調(diào)控甚至改變，以期提高次生代謝產(chǎn)物的含量。目前，雖然多數(shù)藥用植物的次生代謝途徑還未完全闡釋清楚，但次生代謝途徑中關(guān)鍵酶基因已有很多報(bào)道。LEE 等[27]、SHIBATA[28]構(gòu)建了人參氧化鯊烯合成酶的超表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化人參毛狀根后，其中所含的三萜皂苷比對(duì)照組明顯提高；除了超表達(dá)研究，對(duì)人參皂苷合成的支路途經(jīng)進(jìn)行干擾，也能提高目的皂苷的含量。筆者前期研究表明，芪合酶是何首烏二苯乙烯苷合成途徑的關(guān)鍵酶，將含有芪合酶基因的過(guò)表達(dá)載體和RNA 干擾載體導(dǎo)入野生型發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834 中，轉(zhuǎn)化何首烏外植體誘導(dǎo)生成毛狀根，結(jié)果表明，芪合酶過(guò)表達(dá)的何首烏毛狀根中二苯乙烯苷含量是空白組的2.41 倍，而RNA 干擾組二苯乙烯苷合成明顯減少[29]。

3 展望

藥用植物離體培養(yǎng)技術(shù)日益提高，無(wú)疑成為解決藥用植物資源短缺的有效手段。目前，除了人參細(xì)胞培養(yǎng)有工業(yè)化的報(bào)道以外，多數(shù)藥用植物的離體培養(yǎng)還在實(shí)驗(yàn)室階段。所以對(duì)離體培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行優(yōu)化和篩選，對(duì)離體培養(yǎng)條件甚至培養(yǎng)反應(yīng)器進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)，解決植物細(xì)胞傳代后的老化問(wèn)題，是藥用植物離體培養(yǎng)工業(yè)化的前提條件。離體培養(yǎng)技術(shù)在藥用植物的快速繁殖和有效成分的積累方面無(wú)疑具有明顯的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)離體培養(yǎng)技術(shù)對(duì)次生代謝產(chǎn)物的代謝途徑進(jìn)行研究，將可以通過(guò)基因調(diào)控的手段，從根源上提高次生代謝產(chǎn)物的含量，成為解決藥用植物資源危機(jī)的有效手段，也為開(kāi)拓藥用植物的應(yīng)用領(lǐng)域提供了廣闊的前景。