張 月 周厚妊 辛 瑩 李詩慧 劉小奇 劉治軍

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像學(xué)的快速發(fā)展，其結(jié)合產(chǎn)物——分子影像學(xué)逐漸成為研究熱點。超聲分子影像學(xué)作為一重要組成部分，具有特異性高、敏感性強、安全、無創(chuàng)、方便等優(yōu)點，亦成為當(dāng)前分子影像學(xué)領(lǐng)域的研究熱點。超聲靶向微泡破壞（ultrasound-targeted microbubble destruction，UTMD）技術(shù)隨著時代的發(fā)展而出現(xiàn)，為疾病的治療增加了更多選擇。本文就UTMD技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、UTMD的主要作用機(jī)制

UTMD是將生物活性物質(zhì)或治療基因注入或摻入微泡中并輸送至血液循環(huán)，最終在超聲的作用下破壞微泡并將其釋放到靶組織或靶器官的技術(shù)［1］。該技術(shù)可向特定部位發(fā)射不同強度的超聲波，當(dāng)超聲強度足夠大時血液中的微泡便會發(fā)生破裂，破裂后的微泡產(chǎn)生微射流和沖擊波，促使周圍的血管壁或細(xì)胞膜表面出現(xiàn)可逆或不可逆的小孔，增加了血管或細(xì)胞膜的通透性，也增加了外源性物質(zhì)到達(dá)特定部位的劑量，從而發(fā)揮其特有的生物學(xué)效應(yīng)［2］。其中，最主要的是空化效應(yīng)，也是UTMD發(fā)揮作用的主要機(jī)制［3］，UTMD誘導(dǎo)的空化效應(yīng)又分為穩(wěn)定空化和慣性空化，兩種空化方式對細(xì)胞有不同的生物學(xué)改變。在穩(wěn)定空化條件下，微泡的機(jī)械振動和體積變化不僅可以通過離子濃度改變細(xì)胞膜電位，還可以對細(xì)胞膜產(chǎn)生剪切力，刺激細(xì)胞內(nèi)吞，從而促進(jìn)跨細(xì)胞膜基因的轉(zhuǎn)運；慣性空化也會引起細(xì)胞膜電位的變化，不僅可產(chǎn)生瞬時剪切力，還能對細(xì)胞產(chǎn)生強烈的沖擊和熱效應(yīng)，破壞細(xì)胞膜的完整性。與穩(wěn)定空化相比，慣性空化誘導(dǎo)了更大尺寸的膜孔形成，實現(xiàn)了大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)運。

二、UTMD與其他載體聯(lián)合使用介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染

1.UTMD與脂質(zhì)體聯(lián)用：脂質(zhì)體是人工合成的雙層磷脂囊泡，因其具有類細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、高生物相容性、低免疫原性、能保護(hù)藥物或活性基團(tuán)、延長藥物半衰期及增效減毒等優(yōu)勢，已成為有效傳遞活性生物化合物的一種有前途的載體。雖其具有轉(zhuǎn)染效率低、表達(dá)時間短等缺點，但上述不足均可聯(lián)合UTMD應(yīng)用得到解決。外源性質(zhì)粒DNA要進(jìn)入細(xì)胞核，就必須與包涵體解離，而脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染最重要的限速步驟正是如此。研究［4］表明，UTMD產(chǎn)生的空化效應(yīng)是UTMD聯(lián)合脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的主要機(jī)制，也是其提高脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率的主要原因。Xu等［5］分析UTMD聯(lián)合脂質(zhì)體提高效率的原因：①脂質(zhì)體雖對質(zhì)粒DNA有良好的包封率，但部分仍可能在脂質(zhì)體外；②轉(zhuǎn)染后僅小部分DNA可從包涵體中釋放，而空化作用可促進(jìn)其釋放；③細(xì)胞有清除外源性物質(zhì)的能力，部分DNA可被細(xì)胞通過胞吐作用排出，空化作用產(chǎn)生的沖擊波和微射流可在一定程度上抑制細(xì)胞的胞吐作用，提高脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染效率。Chen等［6］發(fā)現(xiàn)輔酶Q10-脂質(zhì)體聯(lián)合UTMD顯著增強了輔酶Q10在腎臟中的特異性分布，可能是預(yù)防糖尿病腎病發(fā)生的潛在策略。

2.UTMD與外泌體聯(lián)用：外泌體是由細(xì)胞分泌的納米級磷脂雙層囊泡，可以通過攜帶多種生物大分子如RNA、DNA、蛋白質(zhì)等在細(xì)胞間傳遞信息，介導(dǎo)多種生理和病理功能，亦被視為是一種非常有前途的藥物載體。然而，心臟、脂肪組織及骨骼肌對外泌體具有耐藥性，在治療上提高這些組織或器官的藥物傳遞效率，可能擴(kuò)大外泌體的潛在應(yīng)用范圍。Sun等［7］研究表明，UTMD誘導(dǎo)產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以瞬間破壞微血管系統(tǒng)，增加了外泌體在心臟、脂肪組織等耐藥器官中的浸潤，UTMD作為一種新的組織特異性基因傳遞手段，可使外泌體進(jìn)入心臟、脂肪和肌肉組織，為這些器官或組織的基因治療帶來了希望。

3.UTMD與聚合物膠束聯(lián)用：聚合物膠束是通過嵌段共聚物的自組裝而形成的核殼型納米粒子，由于其尺寸、穩(wěn)定性、藥物摻入效率及釋放速率等關(guān)鍵特性均可以通過設(shè)計嵌段共聚物來調(diào)節(jié)，因此是最具前途的納米載體之一［8］。UTMD與聚合物膠束的結(jié)合會帶來一種全新的疾病檢測模式，研究［9］報道根據(jù)超聲與聚合物膠束相互作用機(jī)制的不同，可將超聲介導(dǎo)的聚合物膠束藥物遞送分為兩種：一種是基于超聲波對膠束的物理破壞和有效載荷的可逆釋放，另一種是基于膠束超聲機(jī)械化學(xué)破壞和載荷的不可逆釋放。Wu等［10］成功研制出具有超聲反應(yīng)特性的新型載姜黃素的聚合物膠束，并發(fā)現(xiàn)其能顯著抑制腫瘤生長。

4.UTMD與病毒載體聯(lián)用：轉(zhuǎn)染效率高、表達(dá)持續(xù)的病毒載體是將治療基因輸入靶細(xì)胞的最常用工具。但病毒載體自身存在毒性且缺乏特異性，常會引起免疫副反應(yīng)［11］。UTMD與病毒載體結(jié)合具有協(xié)同作用，可以改善病毒載體的不足。微泡通過超聲輻射提高了特定部位釋放的強度，進(jìn)而提高了病毒載體的特異性；UTMD通過空化作用產(chǎn)生的微射流可以增強細(xì)胞膜和毛細(xì)血管的穿透性，克服內(nèi)皮屏障；此外，微泡可以對病毒引起的免疫應(yīng)答施加限制，允許靜脈注射作為傳遞方式，因此摻入微泡中的病毒載體可允許血管內(nèi)給藥和重復(fù)注射［12］。UTMD不僅提高了病毒載體的效率，還避免了病毒載體的免疫原性，使病毒載體能更好地應(yīng)用于臨床。Li等［13］發(fā)現(xiàn)單獨應(yīng)用重組腺相關(guān)病毒血清2型轉(zhuǎn)染到人腎細(xì)胞癌的效率很低，但聯(lián)合UTMD可將病毒轉(zhuǎn)移效率提高2～3倍，病毒基因組DNA提高9倍以上，且不會降低細(xì)胞活力，表明UTMD可與重組腺相關(guān)病毒血清2型聯(lián)合用于癌癥的基因治療。

三、UTMD在疾病治療中的應(yīng)用

1.腫瘤：UTMD作為一種新興的基因傳遞方式，其介導(dǎo)自殺基因的轉(zhuǎn)染亦是一種極具前景的腫瘤治療技術(shù)［14］。單純皰疹病毒胸苷激酶/更昔洛韋（HSV-TK/GCV）系統(tǒng)是目前最成熟有效的自殺基因療法，TK基因是藥敏基因，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染該基因后，對前體藥物丙氧鳥苷或無環(huán)鳥苷變得敏感，故能被殺死［15］。Zhou等［16］研究結(jié)果表明UTMD技術(shù)介導(dǎo)HSV-TK基因的轉(zhuǎn)染能有效抑制小鼠卵巢癌。王玲等［17］制備了載HSV-TK基因脂質(zhì)納米微泡，表明載HSV-TK基因的納米微泡聯(lián)合UTMD對甲胎蛋白陽性的肝癌細(xì)胞有明顯抑制作用。

2.心血管疾?。篠hentu等［18］研究表明，利用UTMD可成功轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長因子基因至心臟，并以P-選擇素為靶向部分提高了轉(zhuǎn)染效率，血管內(nèi)皮生長因子的成功表達(dá)增加了心肌血管密度，改善了缺血心肌功能。Cui等［19］研究表明UTMD與核定位信號聯(lián)合構(gòu)建的親核傳遞系統(tǒng)促進(jìn)了治療基因在犬心肌梗死模型中的表達(dá)，有效地增加了血管生成，提高了轉(zhuǎn)染效率。Huang等［20］發(fā)現(xiàn)通過UTMD下調(diào)腎臟G蛋白偶聯(lián)受體4型表達(dá)可以降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓。

3.關(guān)節(jié)炎：Wang等［21］建立了膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠模型，發(fā)現(xiàn)UTMD能顯著提高腫瘤壞死因子受體基因轉(zhuǎn)染大鼠肌肉和滑膜炎癥的效率，改善關(guān)節(jié)炎癥狀，降低滑膜組織和外周血炎癥因子水平。Xiang等［22］也發(fā)現(xiàn)UTMD可提高增強型綠色熒光蛋白基因在抗原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎兔模型體內(nèi)的轉(zhuǎn)染效率，有望成為一種安全有效的非病毒基因轉(zhuǎn)染治療關(guān)節(jié)炎的方法。

4.其他：Wan等［23］研究證明UTMD與聚乙烯亞胺聯(lián)合應(yīng)用能提高人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和SD大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)質(zhì)粒DNA的基因表達(dá)，且無明顯的組織損傷。Xiang等［24］研究證實UTMD可以同時將胰島素樣生長因子-1cDNA和轉(zhuǎn)化生長因子-βshRNA轉(zhuǎn)染至損傷大鼠的跟腱，提高基因轉(zhuǎn)染效率，且聯(lián)合轉(zhuǎn)染可以改善肌腱的生物力學(xué)性能，為肌腱損傷的基因治療提供了依據(jù)。

四、小結(jié)與展望

UTMD作為基因治療中一種全新的工具，具有毒性小、非免疫原性強、操作簡便等優(yōu)點，是一種發(fā)展前景極佳的治療技術(shù)。但目前UTMD的臨床應(yīng)用仍存在挑戰(zhàn)，如何最大限度地在提高基因轉(zhuǎn)染效率的同時又使其對組織損傷的程度達(dá)到最小，如何更好地提高微泡的包載能力、優(yōu)化超聲參數(shù)和超聲頻率依然是亟需解決的問題。隨著科技的進(jìn)一步發(fā)展和超聲微泡性能的改善，相信今后UTMD可以在人類疾病的診療中發(fā)揮重要作用。