劉 娜 薛 揚(yáng) 唐 杰 張苗怡 任 雪 付建輝

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 上海 200040）

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）導(dǎo)致了全球25% 的卒中及45% 的癡呆病例，嚴(yán)重增加社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)［1］。散發(fā)性CSVD 的主要危險(xiǎn)因素為年齡及高血壓［2］。因此，目前CSVD動(dòng)物模型主要基于高血壓動(dòng)物模型。以血管壁增厚、內(nèi)徑減小為特征的小血管重構(gòu)是CSVD 最重要的病理表現(xiàn)，而血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）在血管重構(gòu)中起重要作用。VSMCs 是一種可塑性極強(qiáng)的細(xì)胞，具有收縮型及合成型兩種表型［3］。在生理狀態(tài)下，VSMCs 表現(xiàn)為收縮表型，維持血管正常收縮舒張功能。然而在病理狀態(tài)下（包括血管受損，高血壓），VSMCs 可由收縮型轉(zhuǎn)換為合成型，表現(xiàn)為細(xì)胞合成、分泌功能旺盛，血管壁基質(zhì)因而增加，導(dǎo)致血管重構(gòu)發(fā)生。VSMCs收縮型標(biāo)志包括α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α smooth muscle actin，αSMA），平滑肌22α 蛋白（smooth muscle 22 alpha，SM22α）等［4-5］。細(xì)絲蛋白a（filamin a，F(xiàn)LNa）是一種重要的細(xì)胞骨架蛋白［6］，有研究發(fā)現(xiàn)FLNa 的增加提示平滑肌細(xì)胞由收縮型向合成型轉(zhuǎn)換［7-9］。目前，大血管疾病的研究提示VSMCs 從收縮型轉(zhuǎn)換為合成型在高血壓導(dǎo)致的大血管重構(gòu)中起重要作用［10］。然而，在CSVD 的研究中，腦小動(dòng)脈管壁VSMCs 表型變化的研究仍然較少。

本文擬采用易卒中型腎血管性高血壓大鼠模型（stroke-prone renovascular hypertensive rat，RHRsp）對(duì)CSVD 病程中腦小血管管壁VSMCs 表型標(biāo)志的改變進(jìn)行研究。RHRsp 是由國(guó)內(nèi)學(xué)者主創(chuàng)的一種通過(guò)雙腎雙夾手術(shù)產(chǎn)生穩(wěn)定的高血壓表型的動(dòng)物模型［11］。RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增厚、內(nèi)徑減小等血管重構(gòu)表型，是一種相對(duì)理想的CSVD 動(dòng)物模型。同時(shí)，小靜脈病變也是CSVD 的重要病理表現(xiàn)之一，雖然早在1995 年Moody 等［12］就曾報(bào)道腦靜脈血管壁基質(zhì)的沉積，提出“腦室周?chē)o脈膠原病”一詞。但對(duì)于腦小靜脈病變與高血壓的關(guān)系目前研究仍然較少。因此本研究同時(shí)也觀察RHRsp 在高血壓下腦小靜脈的重構(gòu)表現(xiàn)。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12 只雄性SD 大鼠（70～90 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，隨機(jī)均分為RHRsp 組及假手術(shù)組，所有動(dòng)物均飼養(yǎng)于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所。

RHRsp 模型制作對(duì)RHRsp 組大鼠使用U 型銀夾縮窄雙側(cè)腎動(dòng)脈［11］，假手術(shù)組（正常對(duì)照組）行相同開(kāi)腹及分離腎動(dòng)脈操作但不鉗夾腎動(dòng)脈。術(shù)后8 周，使用尾動(dòng)脈血壓計(jì)測(cè)定大鼠收縮壓。

腦組織取材及冰凍切片制作兩組大鼠均正常飼養(yǎng)至術(shù)后7 個(gè)月。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，以戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)等滲鹽水、4%多聚甲醛依次心臟灌流后，取腦組織繼續(xù)后固定于4%多聚甲醛中4～6 h。隨后進(jìn)行梯度蔗糖脫水，OCT 包埋，制作10 μm 冰凍切片。切片選擇層面為前囟前3.0 mm（前囟+3.0 mm）、前囟后0.24 mm（前囟-0.24 mm）及前囟后3.0 mm（前囟-3.0 mm）。

腦組織冰凍切片免疫熒光取冰凍切片室溫復(fù)溫后，使用0.25% 的聚乙二醇辛基苯基醚（TritonX-100）破膜15 min。5%的山羊血清（武漢博士德生物工程有限公司）室溫封閉1 h 后一抗4 ℃孵育過(guò)夜。使用一抗包括：抗αSMA 抗體（美國(guó)Sigma-Aldrich 公司），抗FLNa 抗體（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），抗SM22α 抗體，抗Ⅳ型膠原蛋白（collagen Ⅳ，COL4）抗體，抗層粘連蛋白抗體（laminin，LN）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。隨后對(duì)應(yīng)二抗（Alexa Fluor cy3 二抗及488-conjugated 二抗，1∶1 000，美國(guó)Invitrogen Carlsbad 公司）室溫孵育1 h。4′，6-二脒基-2-苯基吲哚染核封片，熒光顯微鏡下觀察拍片。每只大鼠選取3 張不同層面腦組織切片，每個(gè)層面在皮層、基底節(jié)、海馬、丘腦等不同腦區(qū)隨機(jī)拍攝至少3 個(gè)視野。拍攝選取10×物鏡，同一觀察指標(biāo)在同一曝光時(shí)間、背景校正參數(shù)下進(jìn)行拍攝，拍攝圖像分辨率為1 600×1 200。選取內(nèi)徑為10～65 μm 的腦小血管進(jìn)行分析，有連續(xù)的αSMA 表達(dá)的血管視為小動(dòng)脈，否則為小靜脈。使用Image J（V1.8.0）軟件在圖像中選擇目標(biāo)血管，并獲取目標(biāo)血管各參數(shù)的熒光值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 24.0 軟件處理數(shù)據(jù)，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示。各組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，方差齊的兩組采用t檢驗(yàn)，方差不齊的兩組行Welch’st檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

血壓測(cè)量結(jié)果雙腎雙夾術(shù)后2 個(gè)月測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈收縮壓，RHRsp 組血壓顯著高于假手術(shù)組［（196.5±9.07）mmHgvs.（121.3±8.19）mmHg，t=15.06，P＜0.000 1，圖1，1 mmHg=0.133 kPa，下同］。實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)前，雙腎雙夾術(shù)后7 個(gè)月重新測(cè)量大鼠尾動(dòng)脈血壓，RHRsp 組血壓仍然維持較高水平［（206.3±7.6）mmHgvs.（122.5±3.94）mmHg，t=23.99，P＜0.000 1，圖1］。

圖1 大鼠尾動(dòng)脈收縮壓Fig 1 Systolic blood pressure of rats

腦小動(dòng)脈血管壁平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)情況與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)志αSMA、SM22α 表達(dá)均顯著增高。同時(shí)RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞合成型標(biāo)志FLNa 亦顯著高于假手術(shù)組（表1、圖2）。

圖2 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)情況Fig 2 Phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats

表1 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

表1 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞表型標(biāo)志表達(dá)情況Tab 1 The expression of phenotypic markers of the smooth muscle cells in cerebral small arteries of rats （）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；αSMA：α smooth muscle actin；SM22α，smooth muscle 22 alpha；FLNa：Filamin a.

腦小動(dòng)脈血管壁LN 及COL4 表達(dá)情況細(xì)胞外基質(zhì)是血管壁結(jié)構(gòu)和功能完整性的重要組成部分。其中COL4 以及LN 是血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的兩大重要組成成分。VSMCs 是參與分泌血管壁細(xì)胞外基質(zhì)的重要細(xì)胞。我們發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈血管壁細(xì)胞外基質(zhì)LN 及COL4 表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖3、4）。

腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達(dá)情況根據(jù)既往研究報(bào)道［13］，我們將直徑在10～60 μm，沒(méi)有連續(xù)αSMA 表達(dá)的小血管視為小靜脈。與假手術(shù)組大鼠相比，RHRsp 大鼠腦小靜脈血管壁LN 及COL4 表達(dá)均顯著增高（表2、圖3、4）。

表2 大鼠腦小動(dòng)脈及腦小靜脈血管壁基質(zhì)表達(dá)情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

表2 大鼠腦小動(dòng)脈及腦小靜脈血管壁基質(zhì)表達(dá)情況Tab 2 The expression of vessel wall extracellular matrix in cerebral small arteries and venules of rats（）

RHRsp：Stroke-prone renovascular hypertensive rat；SD：Sprague Dawley rat；COL4：Collagen Ⅳ；LN：Laminin.

討論

本研究中，RHRsp 大鼠在雙腎雙夾術(shù)后2 個(gè)月開(kāi)始表現(xiàn)穩(wěn)定的高血壓，術(shù)后7 個(gè)月的病理檢測(cè)發(fā)現(xiàn)RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈VSMCs 收縮型標(biāo)志及合成型標(biāo)志均顯著增加，同時(shí)大鼠腦小動(dòng)脈及小靜脈血管壁基質(zhì)均顯著增加，表現(xiàn)出管壁增厚，內(nèi)徑減小的腦小血管病血管重構(gòu)表現(xiàn)。

圖4 大鼠腦小動(dòng)脈及腦小靜脈血管壁LN 表達(dá)情況Fig 4 The expression of laminin in cerebral small arteries and venules of rats

高血壓是CSVD 的重要危險(xiǎn)因素，高血壓大鼠模型被廣泛應(yīng)用于CSVD 的動(dòng)物研究。RHRsp 模型建模成功后大鼠可表現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)的高血壓，適合用于觀察長(zhǎng)期慢性高血壓對(duì)靶器官的損害［11］。研究報(bào)道RHRsp 表現(xiàn)腦小血管管壁增粗，內(nèi)徑減小等CSVD 病理特征［13］，同樣在本研究中也發(fā)現(xiàn)相似表現(xiàn)，是良好的CSVD 動(dòng)物模型。

在疾病早期，血管重構(gòu)可以視為機(jī)體對(duì)抗病理狀態(tài)的代償反應(yīng)，但持續(xù)的血管重構(gòu)將導(dǎo)致血管正常功能的喪失，進(jìn)而表現(xiàn)為失代償。VSMCs 在血管重構(gòu)中起重要作用。高血壓狀態(tài)下，剪切力、環(huán)形張力等血流動(dòng)力學(xué)的改變可引起VSMCs 的表型發(fā)生改變。既往研究提示5 月齡自發(fā)性高血壓大鼠［14］以及術(shù)后6 個(gè)月的RHRsp［13］腦小動(dòng)脈VSMCs收縮型標(biāo)志αSMA 表達(dá)增加。而本研究發(fā)現(xiàn)，雙腎雙夾術(shù)后7 個(gè)月的RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈VSMCs 不僅αSMA 表達(dá)上升，其另一重要收縮型標(biāo)志SM22α表達(dá)也顯著增高。SM22α 僅在收縮型VSMCs 中高表達(dá)，參與VSMCs 表型轉(zhuǎn)換中絲狀肌動(dòng)蛋白的聚合過(guò)程，具有高度特異性［15］。與之相反的是，肺動(dòng)脈高壓疾病中肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞收縮型表型標(biāo)志下降［16］，同時(shí)在自發(fā)性高血壓大鼠中腸系膜小動(dòng)脈也存在αSMA 表達(dá)下降［17］。我們猜測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同可能是由于不同組織血管床的特異性或疾病進(jìn)程的不同導(dǎo)致的。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，術(shù)后7個(gè)月的RHRsp 大鼠中腦小動(dòng)脈VSMCs 中的FLNa表達(dá)上升。FLNa 是一種在平滑肌細(xì)胞豐富表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白［6］，有研究提示FLNa 在合成型VSMCs 中表達(dá)增加［8-9］，同時(shí)抑制FLNa 表達(dá)可以阻礙VSMCs 向合成型轉(zhuǎn)換［7］。這些都提示VSMCs中的FLNa 表達(dá)上升指示VSMCs 從收縮型向合成型轉(zhuǎn)換。我們的研究進(jìn)一步確認(rèn)了術(shù)后7 個(gè)月的RHRsp 大鼠中腦小動(dòng)脈血管壁基質(zhì)LN 及COL4 表達(dá)均顯著增加，提示平滑肌細(xì)胞合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)的功能旺盛。因此，我們猜測(cè)，在雙腎雙夾術(shù)后7 個(gè)月，RHRsp 大鼠腦小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞處于活躍增殖及分泌狀態(tài)，導(dǎo)致血管壁厚增粗、內(nèi)徑減小。CSVD 患者的尸檢研究提示CSVD 終末期病理改變?yōu)檠芷交〉耐呓饧把鼙诨|(zhì)的增生［18］。事實(shí)上，目前大部分的動(dòng)物模型病理研究均能發(fā)現(xiàn)腦小血管的管壁基質(zhì)增生，但平滑肌瓦解仍然較少見(jiàn)，提示后續(xù)研究可能需要進(jìn)一步優(yōu)化動(dòng)物模型。

此外，本研究進(jìn)一步證實(shí)，在高血壓動(dòng)物模型中，腦小動(dòng)脈血管重構(gòu)同時(shí)腦小靜脈也出現(xiàn)顯著血管壁基質(zhì)增生。既往研究也提示，術(shù)后6 個(gè)月的RHRsp 表現(xiàn)腦小靜脈管壁膠原沉積增加［13］，本研究也證實(shí)，高血壓大鼠腦小靜脈管壁不僅膠原類(lèi)型的基質(zhì)沉積增加，其他管壁基質(zhì)例如LN 也沉積增加。事實(shí)上，我們的早期研究亦提示自發(fā)性高血壓大鼠也存在腦小靜脈重構(gòu)的表現(xiàn)［19］，高血壓作為危險(xiǎn)因素與腦小靜脈管壁重構(gòu)的關(guān)系及其中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，缺氧及低灌注后的氧化應(yīng)激可能是重要因素［13，20］。目前已有研究提示，白質(zhì)靜脈病變影響靜脈血回流可能在皮質(zhì)下微梗死中起重要作用［21］。因此后續(xù)針對(duì)CSVD 的研究應(yīng)該對(duì)于腦小靜脈的病變給予同樣的重視。