周建森， 周秋婷， 葉 芬， 林春通， 劉航琪， 劉樹(shù)滔

（福州大學(xué) 生物工程研究所，福建 福州350002）

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）是結(jié)腸的一種慢性特發(fā)性炎癥性腸病[1]。UC的發(fā)病機(jī)制很復(fù)雜，目前尚不明確。越來(lái)越多的證據(jù)表明，活性氧（ROS）在UC的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。ROS是一類(lèi)含氧元素、具有高活性的小分子物質(zhì)，主要包括·O2-、H2O2和·OH-。ROS是體內(nèi)正常氧代謝的中間代謝產(chǎn)物，主要由線(xiàn)粒體呼吸鏈和NADPH氧化酶系統(tǒng)生成[2]。在正常情況下，機(jī)體的ROS和抗氧化水平處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，并維持細(xì)胞和組織的正常功能。但是，當(dāng)ROS超出平衡時(shí)，過(guò)量的ROS會(huì)造成生物分子（如磷脂、蛋白質(zhì)、核酸）的氧化損傷，導(dǎo)致組織和細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能異常[3-4]。過(guò)量的ROS可以通過(guò)補(bǔ)充外源性的抗氧化劑來(lái)去除。

已有報(bào)道，多種抗氧化劑被應(yīng)用于治療UC。例如，口服N-乙酰半胱氨酸（NAC）[5]、天然植物提取的多酚類(lèi)化合物[6]等均可以改善UC動(dòng)物模型結(jié)腸中的抗氧化狀態(tài)，減輕結(jié)腸炎癥。但是，這些抗氧化劑都是非特異性，可能有副作用，如引起惡心、嘔吐，甚至導(dǎo)致腎臟損傷等等[7-9]。

超氧化物歧化酶（SOD）是機(jī)體內(nèi)源性自由基清除劑中重要的酶類(lèi)抗氧化劑，也可望用于治療UC。它可以催化兩個(gè)超氧化物陰離子之間發(fā)生歧化反應(yīng)，生成對(duì)人體傷害較低的過(guò)氧化氫和氧氣，其中的過(guò)氧化氫可以在過(guò)氧化物酶的作用下轉(zhuǎn)化成對(duì)人體完全無(wú)害的H2O和O2[10]。補(bǔ)充SOD傳統(tǒng)的方式是注射給藥。例如，靜脈注射人工合成的卵磷脂化的SOD可以降低UC小鼠的結(jié)腸損傷，但是其合成所用的交聯(lián)劑是否存在副作用仍存在疑問(wèn)[11]?？诜a(bǔ)充SOD是更加安全、方便的給藥方式，但是需要解決胃腸道消化使其失活的問(wèn)題。已有一些口服SOD治療UC的研究。例如，蟲(chóng)膠包被的SOD[12]、超穩(wěn)定的SOD[13]均可抵抗胃腸道的消化并減輕UC小鼠的炎癥。前期研究發(fā)現(xiàn)，TAT-SOD是富含堿性氨基酸的TAT短肽與SOD的融合蛋白，它比SOD穩(wěn)定并具有更好的細(xì)胞粘附性[14]，這種生物粘附性可能會(huì)增強(qiáng)SOD與小腸上皮的黏附，從而延長(zhǎng)SOD與腸道的結(jié)合。另外，脂質(zhì)體包埋可保護(hù)藥物免受酸性條件下胃蛋白酶的破壞[15]，可以提高SOD在腸道的生物利用度。作者嘗試探究TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽修飾和脂質(zhì)體包埋的SOD對(duì)UC模型大鼠的口服治療作用，以期為UC的輔助治療提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

TAT-SOD發(fā)酵液凍干粉：福州大學(xué)生物工程研究所提供；無(wú)水乙醇（分析純）、膽固醇（分析純）、胃蛋白酶（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；大孔樹(shù)脂HPD500：滄州寶恩吸附材料科技有限公司產(chǎn)品；SOD：天津生命科學(xué)應(yīng)用研究所產(chǎn)品；胰酶（分析純）：美國(guó)Amersco公司產(chǎn)品；大豆卵磷脂（分析純）：薩思化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司產(chǎn)品；葡聚糖硫酸鈉（DSS）：MPBiomedicals公司產(chǎn)品；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒：上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TritonX-114：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒：福州新北生化工業(yè)有限公司產(chǎn)品；SD大鼠：上海禹堃實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司產(chǎn)品；大鼠血清脂多糖（LPS）檢測(cè)試劑盒：江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵液中的TAT-SOD的乙醇沉降 稱(chēng)取發(fā)酵液凍干粉狀20 g溶解于100 mL蒸餾水中，充分溶解發(fā)酵液。分取5 mL發(fā)酵液上清置于離心管中，調(diào)整無(wú)水乙醇的添加量，使無(wú)水乙醇最終體積分?jǐn)?shù)為70%。充分混勻后于-20℃下靜置30 min。4℃條件下，以13 000 r/min離心10 min，收集沉淀溶于5 mL SOD酶活力測(cè)定用PBS中，使用鹽酸羥胺法測(cè)定SOD酶活力[17]。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)[16]。

1.2.2 大孔樹(shù)脂純化TAT-SOD經(jīng)過(guò)乙醇沉淀重溶的樣品在4℃下以12 000 r/min離心10 min，取復(fù)溶液過(guò)大孔樹(shù)脂柱，并用0.5 mol/L NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流量為0.6 mL/min，每管5 min，測(cè)定在280 nm吸光值，得到除去大部分色素的樣品。測(cè)定在400 nm及490 nm波長(zhǎng)的吸光值，通過(guò)吸光值的變化，表征發(fā)酵液的脫色率[18]。

1.2.3 TritonX-114相分離法去除細(xì)菌內(nèi)毒素 收集以上所得TAT-SOD溶液與Triton X-114以體積比99∶1混合；于4℃下、800 r/min條件下攪拌30 min；將樣品轉(zhuǎn)移至37℃水浴10 min；經(jīng)25℃、13 000g離心10 min，并取上層水相；以上各步至少循環(huán)2次；收集上層的TAT-SOD溶液，使用細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其中的內(nèi)毒素含量，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)[20]。

1.2.4 TAT-SOD脂質(zhì)體的制備 將以上去除內(nèi)毒素的TAT-SOD溶液，通過(guò)逆相蒸發(fā)法，包埋于脂質(zhì)體。將大豆卵磷脂和膽固醇以質(zhì)量比2∶1加入到裝有30 mL乙醚的茄型瓶中充分溶解；再將溶有適量TAT-SOD的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）10 mL加入到有機(jī)相中，經(jīng)常溫水浴超聲（100 W）5 min；超聲形成的乳液經(jīng)抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（40℃水浴）充分去除有機(jī)相，最終得到TAT-SOD脂質(zhì)體（L-TATSOD）[21]。

1.2.5 TAT-SOD脂質(zhì)體在模擬消化液中的降解情況 將TAT-SOD脂質(zhì)體分別與模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）以體積比1∶3混合，于37℃水浴240 min，并分別檢測(cè)0，15，30，60，120，240 min時(shí) 的SOD酶活力[22]。

1.2.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 選取SD雄性大鼠30只，初始體質(zhì)量（220±15）g，隨機(jī)分成5組，每組6只，分別為模型組、正常組、L-TAT-SOD組、L-SOD組（SOD脂質(zhì)體組）和TAT-SOD組。造模期間，正常組自由飲用滅菌水，其余組大鼠連續(xù)7 d自由飲用3.0 g/dL葡聚糖硫酸鈉（DSS）溶液，構(gòu)建急性結(jié)腸炎模型鼠[23]。造模成功后，分別給予每只大鼠10 000 U/kg的SOD劑量，灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)分組如下：正常組，全程飲用不含DSS滅菌水+灌胃生理鹽水；L-SOD組，全程飲用含3.0 g/dL DSS滅菌水+灌胃L-SOD；TAT-SOD組，全程飲用含3.0 g/dL DSS滅菌水+灌胃TAT-SOD；L-TAT-SOD組，全程飲用含3.0 g/dL DSS滅菌水+灌胃L-TAT-SOD。

1.2.7 結(jié)腸損傷評(píng)價(jià)（DAI評(píng)分） 通過(guò)疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)價(jià)大鼠的結(jié)腸損傷情況：每天記錄大鼠體質(zhì)量、排便情況，評(píng)分后取平均值得出結(jié)腸炎模型大鼠DAI評(píng)分以及其變化趨勢(shì)[24]。

表1 DAI評(píng)分Table 1 DAI score

1.2.8 結(jié)腸密度的測(cè)定 給藥7 d后，解剖大鼠腹腔，找到結(jié)腸，測(cè)定結(jié)腸密度[25]。

1.2.9 結(jié)腸組織的HE染色 取大鼠結(jié)腸組織做固定、脫水、石蠟包埋、切片、HE染色，再于顯微鏡下觀(guān)察[26]。

1.2.10 血清中酶活和LPS的測(cè)定 從小鼠腹主動(dòng)脈取血并按照鹽酸羥胺法測(cè)血清中酶活。用試劑盒測(cè)定血清中的LPS含量，具體步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

用SPSS 24對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05表示差異顯著，記為“*”。

2 結(jié)果與分析

2.1 TAT-SOD的制備

發(fā)酵液經(jīng)過(guò)乙醇沉淀、大孔樹(shù)脂分離、TritonX-114相分離，并檢測(cè)其酶活、蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、脫色率和細(xì)菌內(nèi)毒素等。酶活回收率最終為57.93%，脫色率為94.72%，細(xì)菌內(nèi)毒素由5.6×10-3EU/U降為0.4×10-3EU/U，遠(yuǎn)低于人體給藥的SOD的內(nèi)毒素限度（5.0×10-3EU/U），去除率為99.30%[26]。

2.2 TAT-SOD脂質(zhì)體的制備

相比于TAT-SOD，制備樣品能形成納米顆粒，且其平均粒徑為（261.9±1.664）nm，說(shuō)明已經(jīng)成功制備TAT-SOD脂質(zhì)體（L-TAT-SOD）；其平均電位為（-41.3±4.40）mV≤-30 mV，具有較高的穩(wěn)定性；其PDI為0.226±0.020。數(shù)據(jù)表明，已經(jīng)成功制備L-TAT-SOD，且具有較高的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 L-TAT-SOD的粒徑、電位Fig.1 Particle size and Zeta potential distribution of L-TAT-SOD

2.3 L-TAT-SOD在體外模擬人工胃液（SGF）、人工腸液（SIF）的酶活回收率

如圖2所示，在SGF的作用下，SOD和TATSOD的酶活迅速降低，15 min后幾乎失活；脂質(zhì)體包埋的L-SOD、L-TAT-SOD的酶活損失則比較少，240 min后穩(wěn)定于85%左右。這些說(shuō)明，在模擬胃液中，脂質(zhì)體包埋能有效保護(hù)SOD的活性，TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的修飾對(duì)SOD活性的保護(hù)沒(méi)影響。

如圖3所示，在SIF的作用下，不同SOD樣品的酶活都有小幅度的下降，240 min后穩(wěn)定于90%左右，其酶活保留率順序?yàn)椋篖-TAT-SOD＞L-SOD＞TAT-SOD＞SOD。這些說(shuō)明，在模擬腸液中，脂質(zhì)體包埋和TAT轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的修飾都能一定程度地保護(hù)SOD的活性，且兩者對(duì)SOD的協(xié)同保護(hù)更加明顯。

圖2 不同SOD在SGF中的酶活回收率Fig.2 Enzyme activity recovery of different SOD in SGF

圖3 不同SOD在SIF中的酶活回收率Fig.3 Enzyme activity recoveryof different SOD in SIF

2.4 L-TAT-SOD對(duì)UC大鼠模型的DAI評(píng)分的影響

DAI評(píng)分越高，表明結(jié)腸損傷程度越高，正常生理狀況的DAI評(píng)分為0。如圖4所示，經(jīng)過(guò)灌胃給藥7天的過(guò)程中，與模型組相比，L-TAT-SOD、L-SOD、TAT-SOD組的DAI評(píng)分都呈現(xiàn)顯著性降低（P＜0.05），且呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢(shì)。最終，L-TAT-SOD、L-SOD、TAT-SOD組的DAI評(píng)分分別降低了（71.37±8.97）%、（69.33±6.15）%、（66.67±7.26）%。不同SOD組別之間，L-TAT-SOD組的DAI評(píng)分在第1、2、3天顯著性低于TAT-SOD組（P＜0.05），在第4、5、6、7天無(wú)顯著性差異。而L-TAT-SOD組與LSOD組之間、L-SOD組與TAT-SOD組之間的差異性較低，但存在一定趨勢(shì)。這些部分組別之間存在無(wú)顯著性差異的情況，可能是動(dòng)物實(shí)驗(yàn)誤差范圍較大造成的，這有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

這些數(shù)據(jù)表明，從趨勢(shì)以及DAI評(píng)分的降低情況來(lái)看，治療效果：L-TAT-SOD＞L-SOD＞TAT-SOD，其中L-TAT-SOD的效果最好。

圖4 不同SOD對(duì)DAI評(píng)分的影響Fig.4 Effect of different SOD on DAI score

2.5 L-TAT-SOD對(duì)UC大鼠模型的結(jié)腸密度的影響

結(jié)腸受損后，易纖維化致使密度變大[27]。因此，可以通過(guò)測(cè)定結(jié)腸密度來(lái)評(píng)估結(jié)腸組織的受損情況。如圖5所示：L-TAT-SOD組（0.086±0.012）、LSOD組（0.093±0.014）、TAT-SOD組（0.092±0.016）和與模型組（0.121±0.020）相比，其結(jié)腸密度測(cè)量值均顯著（P＜0.05）低于模型組（0.121±0.020），與正常組（0.088±0.004）相比，無(wú)顯著性差異。表明L-TATSOD、L-SOD、TAT-SOD對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥均有較好的治療效果，且L-TAT-SOD的效果最好，最接近正常組。

圖5 不同SOD對(duì)結(jié)腸密度的影響Fig.5 Effect of different SOD on colon density

2.6 結(jié)腸組織切片染色觀(guān)察

如圖6所示，TAT-SOD組、L-SOD組、L-TATSOD組結(jié)腸組織表現(xiàn)較為相似，與模型組相比，其隱窩結(jié)構(gòu)正常、杯狀細(xì)胞正常、黏膜下層僅有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。表明TAT-SOD、L-SOD、L-TATSOD對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎屏障損傷有明顯的修復(fù)作用。

圖6 不同SOD對(duì)結(jié)腸組織的影響（HE，×100）Fig.6 Effects of different SOD on colonic tissue（HE，×100）

2.7 L-TAT-SOD對(duì)UC大鼠模型的血清中SOD酶活的影響

通過(guò)測(cè)定用藥對(duì)UC模型大鼠的血清中的SOD酶活的影響，來(lái)評(píng)估其對(duì)機(jī)體的抗氧化水平的調(diào)節(jié)情況。如圖7所示，模型組與正常組相比，其血清酶活均顯著（P＜0.05）低于正常組。表明DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥的產(chǎn)生，伴隨著機(jī)體的抗氧化酶水平的下降。而L-TAT-SOD組、L-SOD組和TAT-SOD組的血清酶活均顯著（P＜0.05）高于模型組和正常組。而L-TAT-SOD組的血清酶活顯著（P＜0.05）高于LSOD組、TAT-SOD組。這些結(jié)果表明：L-TAT-SOD、L-SOD、TAT-SOD均能通過(guò)口服灌胃來(lái)提高血清的SOD酶活，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力；而且，L-TATSOD的改善效果要優(yōu)于L-SOD和TAT-SOD。根據(jù)模型組大鼠血清SOD酶活顯著低于正常組的數(shù)據(jù)，推測(cè)3種SOD樣品可能是通過(guò)改善UC狀況，從而提高血清酶活。

圖7 不同SOD對(duì)血清SOD酶活的影響Fig.7 Effect of different SOD on SOD enzyme activity in serum

2.8 L-TAT-SOD、TAT-SOD、L-SOD對(duì)UC大鼠模型的血清中LPS質(zhì)量濃度的影響

UC模型大鼠腸道菌群產(chǎn)生的脂多糖（LPS）相比正常的大鼠更容易通過(guò)損傷的腸道屏障進(jìn)入血液[28]。通過(guò)測(cè)定血清中LPS含量可評(píng)估腸道損傷情況，結(jié)果如圖8所示，血清中LPS含量卻無(wú)顯著性差異。LPS主要來(lái)源于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁[29]，而ROS本身也具有抗革蘭氏陰性菌的活性[30]，由此推測(cè)，這可能是UC大鼠腸道中含有豐富的ROS，抑制了革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，從而使得腸道中可產(chǎn)生LPS的革蘭氏陰性菌的數(shù)量減少。UC大鼠的腸道屏障雖然受到破壞，受損的腸道更容易受到細(xì)菌的感染，但是ROS可能會(huì)造成腸道菌群整體數(shù)量下降，從而導(dǎo)致所測(cè)的LPS表觀(guān)上并無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，SOD作為特異性的抗氧化劑來(lái)治療潰瘍性結(jié)腸炎，受到越來(lái)越多關(guān)注[12-13]。SOD作為酶類(lèi)抗氧化劑，可反復(fù)利用，能高效清除多余的ROS，有很大的應(yīng)用潛力和市場(chǎng)需求。盡管SOD來(lái)源較廣，可從動(dòng)植物中提取得到，但是，其提純的步驟較為復(fù)雜[31]。作者通過(guò)基因工程菌表達(dá)的SOD，更容易獲得，提純工藝也更為簡(jiǎn)單[32]。TAT-SOD發(fā)酵凍干粉僅通過(guò)乙醇沉淀、大孔樹(shù)脂吸附、TritonX-114等步驟，就去除了大部分色素和細(xì)菌內(nèi)毒素，獲得了高比活（11 003 U/mg）的TAT-SOD；與天然SOD相比，TAT-SOD添加了富含堿性氨基酸的短肽TAT，提高了其對(duì)細(xì)胞表面的黏附能力[14]，這為SOD應(yīng)用于UC模型大鼠治療提供了良好的基礎(chǔ)。

圖8 不同SOD對(duì)血清LPS質(zhì)量濃度的影響Fig.8 Effect of different SOD on LPS content in serum

天然SOD本身存在相對(duì)分子質(zhì)量大、傳遞時(shí)難透過(guò)細(xì)胞膜、半衰期短、難耐酸、容易被胃蛋白酶降解等缺點(diǎn)，限制了其臨床應(yīng)用。前人用卵磷脂化和季銨化殼聚糖等化學(xué)修飾的方法，顯著提高其靜脈注射后SOD在血液中的半衰期，但是，靜脈注射給藥方式的舒適度有待提高[11]。利用脂質(zhì)體包埋TATSOD，在體外模擬消化液降解的試驗(yàn)中，能夠保護(hù)80%以上的TAT-SOD活性免受胃液環(huán)境的破壞，達(dá)到口服給藥的要求，進(jìn)一步提高了UC模型大鼠治療時(shí)的生活質(zhì)量評(píng)分（QOL）。

作者通過(guò)葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘發(fā)的大鼠結(jié)腸炎模型來(lái)評(píng)估TAT-SOD及L-TAT-SOD的治療效果。結(jié)果表明，L-TAT-SOD能夠顯著地降低結(jié)腸炎大鼠的DAI評(píng)分。此外，結(jié)腸組織的切片染色結(jié)果顯示，L-TAT-SOD能夠減少杯狀細(xì)胞的丟失、減少炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，這可能是SOD可以部分恢復(fù)UC模型大鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白 （如ZO-1和occlaudin-1）的表達(dá)水平[13]，改善腸道屏障，從而抵抗炎性細(xì)胞的入侵。L-TAT-SOD還能夠顯著提高結(jié)腸炎大鼠血清中的SOD酶活水平。鑒于模型組大鼠血清SOD酶活顯著低于正常組的數(shù)據(jù)，推測(cè)LTAT-SOD可能是通過(guò)改善UC狀況，來(lái)實(shí)現(xiàn)SOD水平的升高[13]；也有可能是通過(guò)降低ROS水平來(lái)改善腸道環(huán)境，部分恢復(fù)腸道菌群的平衡狀態(tài)，進(jìn)一步提高機(jī)體的免疫力和自愈能力來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，相對(duì)于UC模型，DSS誘導(dǎo)的大鼠結(jié)腸炎被認(rèn)為更像是急性腸道炎癥[12]，所以，L-TAT-SOD對(duì)慢性腸道炎癥模型的治療效果有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

與口服SOD樣品相比，作者制備的SOD樣品原料來(lái)源更廣、制造成本更低[12]。與從嗜熱菌中分離得到的超穩(wěn)定SOD相比，分離純化步驟更簡(jiǎn)單[13]。

綜上所述，口服L-TAT-SOD、L-SOD、TATSOD對(duì)于DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎大鼠均有積極的治療效果。其中，L-TAT-SOD的治療效果最好，TATSOD和L-SOD的治療效果相當(dāng)。這可能是因?yàn)橹|(zhì)體包埋有效避免其在胃腸道中酸解和酶解[22]，TAT短肽富含堿性氨基酸的結(jié)構(gòu)提高了SOD對(duì)腸道的黏附能力[14]，可能也會(huì)改善SOD的作用。因此，口服L-TAT-SOD作為治療潰瘍性結(jié)腸結(jié)腸炎的輔助治療手段具有良好的應(yīng)用前景。